Highlights

1、單(dan)細胞時空組學(xue)助力精準醫學(xue)發展；

2、全文解析如何利用(yong)單細(xi)胞(bao)測序(xu)挖掘生物學故事；

3、派森諾單細胞轉錄組測序高級分析助力老師科研。

各位老師(shi)們，開(kai)學了(le)開(kai)學了(le)！

哎但(dan)為啥派派發現你愁(chou)眉苦臉(lian)的

難不成是因為基金本子(zi)沒寫完

思(si)路(lu)有點卡頓了？

還是因(yin)為數據分析卡住(zhu)了，找不到突(tu)破口(kou)？

那怎么樣才能解決(jue)你的困擾呢？做個單細胞測序吧，通過火紅(hong)的組學技術(shu)，深入(ru)研(yan)究生命(ming)科學的無窮奧(ao)秘吧！那么敢(gan)問天下(xia)單細胞技術(shu)誰比較優秀，請看下(xia)圖(tu)！

但也許有老師會問到，單細胞測序是什么？單細胞測序是一種能夠解析單細胞維度的基因表達變化的檢測手段，如果(guo)把普通轉(zhuan)錄組測序比(bi)做將水果(guo)打勻后(hou)后(hou)的(de)果(guo)汁奶昔，那么(me)單細(xi)胞測序就好比(bi)是果(guo)盤，能直接觀察每(mei)一(yi)個細(xi)胞的(de)特(te)征(zheng)。所以單細胞(bao)測(ce)序可(ke)以很好的(de)去(qu)解析(xi)組織(zhi)內部異質性，為解析(xi)低(di)占比但可(ke)能扮演(yan)疾病演(yan)化、生理發生中的(de)重要作用的(de)細胞(bao)提供(gong)強有力的(de)研究工具。

從2009年湯富酬教授劃時代地在Nature Methods上發表單細胞測序mRNA測序方法學文章開始，單細胞便開始作為生命科學研究領域的“網紅”大殺四方，在各種頂刊曝(pu)光，并解(jie)決數以萬計的科學(xue)難題，讓(rang)我們為單細胞測序(xu)點個贊。

15年過去了，他不斷(duan)(duan)演(yan)變，變成高(gao)通量、高(gao)效率(lv)的(de)(de)生(sheng)命科(ke)學工(gong)具，并擴(kuo)展到了單(dan)細(xi)胞ATAC，單(dan)細(xi)胞ChIP以(yi)及單(dan)細(xi)胞微(wei)生(sheng)物等技術，圍繞著生(sheng)命中心(xin)法則不斷(duan)(duan)發(fa)展壯(zhuang)大(da)他的(de)(de)應(ying)用場景。隨著熱潮的(de)(de)不斷(duan)(duan)來臨(lin)以(yi)及高(gao)分文章的(de)(de)不斷(duan)(duan)發(fa)表，有不少的(de)(de)老師會發(fa)出疑問(wen)：

如此多領域的生命科學研究已經用單細胞測序技術進行了機理挖掘以及細胞類型的梳理，那單細胞測序技術(shu)是否還(huan)有應用場景(jing)，他(ta)是否還(huan)值得(de)被人(ren)們(men)重視呢(ni)？

答案是：他依然作為一(yi)款高(gao)效便捷的科(ke)學工具在(zai)生(sheng)物醫學、農學以及(ji)畜(chu)牧類領(ling)域發(fa)揮(hui)著巨大作用。

那么單(dan)細胞(bao)的(de)應(ying)用場景在(zai)于哪些呢？人類最得(de)力的助手deepseek的回答是這(zhe)樣的：

那么讓課代表來升華(hua)下deepseek的話語：

1、單細胞測序可以發(fa)現生命體中同種細胞間(jian)是如何相互間(jian)轉化(hua)以及分(fen)化(hua)過(guo)程中的驅動基因；

2、單細(xi)胞(bao)測序(xu)可(ke)以挖掘細(xi)胞(bao)群內各(ge)種細(xi)胞(bao)間是否存在(zai)相互交流以及(ji)交流的(de)細(xi)胞(bao)間是通(tong)過哪些(xie)基因去進(jin)行(xing)信息傳(chuan)遞(di)的(de)；

3、比(bi)較同一(yi)種細(xi)胞(bao)群內(nei)，在不同階段(duan)或(huo)者不同處理的影響下，基因表達的變化是什么。

以及其他進一步的數據挖掘需求，那么單細胞測序是如何通過生信分(fen)析來(lai)實現(xian)上述功能的呢？接(jie)下來(lai)我們婉(wan)婉(wan)道(dao)來(lai)。

對于單細胞數據分析來說，主要分為三大模塊，即：數(shu)據的前(qian)處理、細胞鑒定、以及下游功能研究分析，以上三者共同構成了單細胞測序數據分析大(da)廈的地基、骨架以及墻(qiang)壁。

1.數據(ju)前(qian)處理

單(dan)細胞轉(zhuan)錄組主流的技(ji)術路線仍然以微流控技(ji)術形成油包水(shui)反應體(ti)(ti)系(xi)(xi)去構建單(dan)細胞基因(yin)捕獲和檢(jian)測體(ti)(ti)系(xi)(xi)，其中10x genomics的chromium平臺是單(dan)細胞微流控的巔峰。

那對于(yu)以(yi)10x為主的(de)微流控單(dan)細(xi)胞轉(zhuan)錄組來說，我(wo)們(men)進(jin)行分析這些(xie)單(dan)細(xi)胞數(shu)(shu)(shu)據的(de)前提是先明確哪(na)些(xie)油滴中有細(xi)胞，哪(na)些(xie)細(xi)胞為高質(zhi)(zhi)量(liang)細(xi)胞，哪(na)些(xie)細(xi)胞可以(yi)用于(yu)下游分析，即數(shu)(shu)(shu)據的(de)前處理，包括(kuo)：數(shu)(shu)(shu)據比對、call cells、低質(zhi)(zhi)量(liang)細(xi)胞以(yi)及多胞的(de)清(qing)除。

數據(ju)比(bi)對：通(tong)過識別(bie)測序序列中(zhong)特定的(de)標簽(qian)以及標簽(qian)對應的(de)cDNA堿基(ji)(ji)信息知道(dao)我們(men)測定的(de)將近100g原(yuan)始數據(ju)中(zhong)每一條序列來自于(yu)哪(na)個油包水以及來源于(yu)那個基(ji)(ji)因(yin)。

Call Cells：通過數(shu)據比對過程，我(wo)們完成測(ce)序(xu)(xu)數(shu)據以油(you)包(bao)水(shui)為(wei)單位的(de)測(ce)序(xu)(xu)原始數(shu)據分(fen)配，此(ci)(ci)時我(wo)們知道了(le)本次測(ce)序(xu)(xu)測(ce)了(le)多(duo)少個油(you)包(bao)水(shui)單位，每個油(you)包(bao)水(shui)中(zhong)的(de)基(ji)因(yin)含量是多(duo)少。但(dan)鑒于我(wo)們的(de)油(you)包(bao)水(shui)包(bao)裹(guo)的(de)液滴中(zhong)同時含有細(xi)(xi)(xi)胞、細(xi)(xi)(xi)胞碎片以及細(xi)(xi)(xi)胞懸液中(zhong)的(de)背景RNA，所(suo)以每個油(you)包(bao)水(shui)或(huo)多(duo)或(huo)少都會被分(fen)配測(ce)序(xu)(xu)數(shu)據，此(ci)(ci)時我(wo)們需要做的(de)是進(jin)行(xing)細(xi)(xi)(xi)胞和非細(xi)(xi)(xi)胞包(bao)裹(guo)的(de)油(you)包(bao)水(shui)進(jin)行(xing)區分(fen)，此(ci)(ci)步(bu)驟即(ji)我(wo)們所(suo)說的(de)Call Cells。

低質量細胞以及多胞的清除：通過Call Cells，我們完成了包裹細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)油(you)包水的(de)識(shi)別，即(ji)明(ming)確了我們下有(you)(you)需要(yao)分(fen)析的(de)數據。在這些(xie)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)中，有(you)(you)些(xie)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)活(huo)率高(gao)(gao)基因表達高(gao)(gao)，但有(you)(you)些(xie)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可能由于(yu)組織處理(li)導致細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)損傷發生(sheng)壞死(si)，或(huo)者(zhe)存在一個油(you)包水包裹了2個以上的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)，這些(xie)數據不是我們需要(yao)分(fen)析的(de)對象，所以在這一步進行(xing)去除。

通過以上三點，我們完成了單細(xi)胞數(shu)據的(de)(de)前處理(li)過程(cheng)，數(shu)據前處理(li)的(de)(de)好與壞，直(zhi)接影(ying)響了下(xia)游生(sheng)物學故事挖掘(jue)的(de)(de)準確性，所以可謂是整個單細(xi)胞數(shu)據分析“大廈(sha)”的(de)(de)地基工程(cheng)，我們會在后(hou)期進行(xing)展開詳解。

2.細胞鑒定

單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)相較于bulk rna sequence的(de)差別在于：單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)轉錄(lu)組測(ce)序可進行針對具體(ti)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型進行功能和(he)差異基(ji)因(yin)的(de)分析。而(er)進行這一(yi)分析前，我們(men)需要做(zuo)的(de)是明(ming)確再進行數據前處理結束后留(liu)存下(xia)來(lai)的(de)高質量的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型有哪些以(yi)及留(liu)存下(xia)來(lai)的(de)每個細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)是什么細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，此步(bu)驟即細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)鑒(jian)定。那(nei)么細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)鑒(jian)定應該如何做(zuo)呢？他分為：基(ji)因(yin)表達的(de)歸一(yi)化(hua)、細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)降(jiang)維(wei)聚類和(he)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)分群(qun)以(yi)及細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)注釋。

基因表達的歸(gui)一化：由于微流控捕獲細(xi)胞系統的(de)(de)不穩定(ding)性造(zao)成最終(zhong)捕獲細(xi)胞數(shu)和預計細(xi)胞數(shu)有接近50%的(de)(de)上下浮動范圍，導(dao)致每個細(xi)胞的(de)(de)測序深度的(de)(de)不一致，進一步(bu)導(dao)致細(xi)胞基因表達水平檢測靈敏度有一定(ding)的(de)(de)變(bian)化，所(suo)以在這里(li)需要通過(guo)歸一化，把測序深度導(dao)致的(de)(de)檢測靈敏度拉到同一水平。

細胞降維(wei)聚類和細胞分群：單細胞測(ce)序的(de)數據量極大(da)，信息捕獲量因此也和常規(gui)組學不一樣，所以直接分(fen)析(xi)龐大(da)的(de)數據會(hui)很有(you)困難，聰(cong)明的(de)人類永遠(yuan)會(hui)化繁為簡，通過(guo)相(xiang)關性(xing)分(fen)析(xi)，將表(biao)達(da)模式相(xiang)似(si)度較高的(de)細胞通過(guo)二維平面的(de)方式進行展示，并劃分(fen)細胞群。

細(xi)胞(bao)注釋(shi)：細(xi)胞(bao)(bao)注釋目(mu)前主(zhu)要(yao)有兩種流(liu)派(pai)，分別為(wei)(wei)自動注釋和(he)手動注釋。自動注釋主(zhu)要(yao)以(yi)SingleR，scCATCH為(wei)(wei)主(zhu)，通過(guo)內置(zhi)的(de)(de)特(te)(te)定(ding)細(xi)胞(bao)(bao)表(biao)(biao)達(da)矩陣(zhen)進行(xing)目(mu)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)相似(si)性比(bi)較，最(zui)終(zhong)確(que)定(ding)細(xi)胞(bao)(bao)類型(xing)；而手動注釋則(ze)方法眾(zhong)多，最(zui)常見的(de)(de)則(ze)為(wei)(wei)marker可視化，通過(guo)特(te)(te)定(ding)細(xi)胞(bao)(bao)為(wei)(wei)了發揮功能而特(te)(te)定(ding)表(biao)(biao)達(da)基因的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)水平(ping)和(he)表(biao)(biao)達(da)比(bi)例(li)來確(que)定(ding)細(xi)胞(bao)(bao)類型(xing)。

細胞(bao)類型確定的(de)正(zheng)確與否，直接決定了后(hou)期生理學故(gu)事(shi)挖掘以及(ji)靶點(dian)確定的(de)可靠性，因此細胞(bao)鑒定可以說(shuo)是整個單(dan)細胞(bao)數據分析(xi)“大廈”的(de)鋼筋鐵(tie)骨，那具體如何(he)進行(xing)細胞(bao)鑒定，以及(ji)方法(fa)的(de)派(pai)森諾式(shi)的(de)多(duo)元化，也(ye)會在后(hou)期進行(xing)詳細展示。

3.下(xia)游(you)功(gong)能研究分析

經過單細胞(bao)轉(zhuan)錄(lu)組數(shu)據前(qian)處理和(he)(he)細胞(bao)鑒(jian)定，我們基(ji)本上就(jiu)把單細胞(bao)“大(da)廈(sha)”的(de)地基(ji)和(he)(he)框(kuang)架(jia)給搭建(jian)完成，那么接下來做的(de)就(jiu)是有(you)效生(sheng)物信息的(de)挖掘，這包(bao)括：組織內(nei)(nei)細胞(bao)分(fen)化(hua)和(he)(he)演化(hua)的(de)探(tan)究(jiu)、轉(zhuan)錄(lu)調(diao)控研究(jiu)、以及差(cha)異(yi)基(ji)因的(de)尋找(zhao)等(deng)，通過以上分(fen)析完成對組織內(nei)(nei)細胞(bao)異(yi)質性的(de)探(tan)究(jiu)。

擬時序分析：組織微環境(jing)內(nei)存在(zai)大量分化階(jie)段(duan)(duan)不一(yi)樣的(de)(de)(de)同種大類(lei)細(xi)胞(bao)(bao)，例如(ru)：腫(zhong)瘤組織內(nei)良性(xing)和惡性(xing)的(de)(de)(de)腫(zhong)瘤細(xi)胞(bao)(bao)，免疫(yi)(yi)風暴過(guo)(guo)程中炎癥因(yin)子表達剛啟動(dong)(dong)和炎癥因(yin)子表達高(gao)峰的(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)細(xi)胞(bao)(bao)，目前也許已經有很多文章(zhang)或者研(yan)究將分化的(de)(de)(de)起點(dian)和終點(dian)探究明(ming)白(bai)，但是(shi)(shi)具(ju)體每個時(shi)間(jian)點(dian)的(de)(de)(de)變(bian)化是(shi)(shi)如(ru)何的(de)(de)(de)以及是(shi)(shi)什么基(ji)(ji)因(yin)去進行驅動(dong)(dong)整個分化過(guo)(guo)程的(de)(de)(de)，可(ke)能(neng)沒(mei)有文章(zhang)報道也沒(mei)有比較好的(de)(de)(de)工具(ju)和方(fang)法(fa)去探究。單細(xi)胞(bao)(bao)轉錄組測(ce)序可(ke)以通(tong)過(guo)(guo)擬(ni)時(shi)序分析(xi)方(fang)法(fa)，模擬(ni)不同細(xi)胞(bao)(bao)類(lei)群在(zai)分化階(jie)段(duan)(duan)的(de)(de)(de)位置，推(tui)算(suan)出(chu)分化階(jie)段(duan)(duan)，并進一(yi)步計算(suan)出(chu)分化過(guo)(guo)程可(ke)能(neng)的(de)(de)(de)推(tui)動(dong)(dong)基(ji)(ji)因(yin)。通(tong)過(guo)(guo)擬(ni)時(shi)序分析(xi)，我們可(ke)以挖掘(jue)出(chu)細(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型(xing)的(de)(de)(de)演化方(fang)向，以及推(tui)動(dong)(dong)演化的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)，進行進一(yi)步的(de)(de)(de)下(xia)游分子生物學驗證研(yan)究。

細(xi)胞互作分析：組織中(zhong)存(cun)在多種不(bu)同(tong)狀態不(bu)同(tong)類型(xing)的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，他們各自表達(da)著(zhu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)特異性的(de)蛋白和小(xiao)分(fen)子物質，這(zhe)些(xie)蛋白有(you)些(xie)可以分(fen)泌到(dao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)基質間，并通過其(qi)他細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)感(gan)應元件調節(jie)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)間的(de)交流，這(zhe)對(dui)于維持微(wei)環(huan)境的(de)工作起到(dao)至關重要(yao)的(de)作用。單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)錄組測序(xu)可根據已有(you)數據庫中(zhong)的(de)配(pei)體-受體關系對(dui)，結合測的(de)對(dui)應配(pei)受體對(dui)應基因的(de)表達(da)水平，挖(wa)掘微(wei)環(huan)境中(zhong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)間通訊信息，為微(wei)環(huan)境分(fen)析(xi)提供數據預測分(fen)析(xi)。

差異(yi)基因(yin)分析：組織中存在(zai)一(yi)些占比(bi)較低(di)的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型，這些細(xi)(xi)胞(bao)(bao)類(lei)型一(yi)方(fang)面無特(te)異性的表面抗原用于細(xi)(xi)胞(bao)(bao)分(fen)選，另外一(yi)方(fang)面比(bi)例(li)低(di)導(dao)致(zhi)分(fen)選困難，因此(ci)如果想知道(dao)他們間的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)基(ji)(ji)因差異便會困難重(zhong)重(zhong)。但(dan)單細(xi)(xi)胞(bao)(bao)可以基(ji)(ji)于細(xi)(xi)胞(bao)(bao)大(da)群(qun)和亞群(qun)的分(fen)析結果，對特(te)定細(xi)(xi)胞(bao)(bao)進行基(ji)(ji)因表達(da)差異分(fen)析。

轉錄調控分析：單細(xi)胞轉(zhuan)錄(lu)組揭示(shi)的(de)(de)是(shi)基(ji)(ji)因(yin)表達變(bian)化(hua)(hua)，但基(ji)(ji)因(yin)表達水平的(de)(de)變(bian)化(hua)(hua)往(wang)往(wang)由上(shang)游(you)的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子調(diao)(diao)控，通(tong)過相關性分析，并構建(jian)潛(qian)在的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)調(diao)(diao)控網絡，便能發(fa)現活化(hua)(hua)的(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子，為后期做scATAC-seq做數據支(zhi)持。

通過以上數(shu)據的挖掘，我們基(ji)本上完成了一(yi)篇單細胞數(shu)據應該有(you)的圖片，高分文章在(zai)向我們招(zhao)手，大家(jia)快沖鴨(ya)。