2017-03-15
以PacBio公司的SMRT單分子實時測序技術（Single molecule real-time sequencing）為代表的三代測序技術，通過其獨有的環形一致性測序模式（Circular-consensus sequence，CCS），極大提高單堿基測序的準確率，遠超Illumina等二代測序技術。與傳統轉錄組測序項目相比，利用PacBio平臺的全長轉錄組測序技術可以直接獲得mRNA的全長，保證了mRNA序列的精確性。近期我們將陸續推出全長轉錄組測序技術相關文章，供討論和交流。我們在上一期向大家介紹了全長轉(zhuan)錄(lu)組測序的分析內容，本期將為大家對派森諾特色分析內容——可變剪切模型可視化進行重點講解。
可變剪切模型可視化
可(ke)(ke)變剪(jian)(jian)切(qie)(qie)是造(zao)成(cheng)基因信息多樣化的一個重(zhong)要原(yuan)因，通(tong)過(guo)對RNA序(xu)列測序(xu)可(ke)(ke)以檢測到基因的不(bu)同(tong)可(ke)(ke)變剪(jian)(jian)切(qie)(qie)模式。今天(tian)為大家介(jie)紹一種可(ke)(ke)以將可(ke)(ke)變剪(jian)(jian)切(qie)(qie)模型繪制成(cheng)圖片的Python軟(ruan)件SpliceGrapher。
SpliceGrapher可(ke)以根(gen)據測序(xu)序(xu)列(lie)預(yu)測可(ke)變剪切模(mo)型(xing)，也(ye)可(ke)以用已知的基(ji)因(yin)注釋文件(jian)(jian)生成可(ke)變剪切模(mo)型(xing)。它需要(yao)兩種輸入文件(jian)(jian)，注釋gtf/gff3文件(jian)(jian)和測序(xu)reads與參考基(ji)因(yin)組比對的sam文件(jian)(jian)，如果有EST序(xu)列(lie)，也(ye)可(ke)以用上。
繪制可變剪切模型(xing)
SpliceGrapher的(de)使用過程(cheng)非常簡單。首先(xian)需(xu)要(yao)去掉sam文(wen)件(jian)(jian)中的(de)假陽性可(ke)變剪(jian)切。這里(li)需(xu)要(yao)用上SpliceGrapher專門準備的(de)物種特性篩(shai)選(xuan)(xuan)(xuan)文(wen)件(jian)(jian)，在SpliceGrapher文(wen)件(jian)(jian)夾下有上百種物種的(de)特性篩(shai)選(xuan)(xuan)(xuan)文(wen)件(jian)(jian)。然(ran)后用篩(shai)選(xuan)(xuan)(xuan)后的(de)sam文(wen)件(jian)(jian)預測可(ke)變剪(jian)切模型(xing)，用注釋gtf/gff3文(wen)件(jian)(jian)產生已知的(de)可(ke)變剪(jian)切模型(xing)。最后用SpliceGrapher的(de)繪(hui)圖腳本將可(ke)變剪(jian)切模型(xing)畫成圖片。
可變(bian)剪切圖解讀
結果(guo)圖蘊含了許(xu)多信息，下(xia)面就為(wei)大家介紹一(yi)下(xia)。
一(yi)個(ge)圖片(pian)中(zhong)僅有一(yi)個(ge)基因的(de)(de)模(mo)型，左(zuo)下角(jiao)和右下角(jiao)的(de)(de)數(shu)字分別代表該(gai)基因的(de)(de)起始位(wei)點和終止(zhi)位(wei)點。圖片(pian)一(yi)共(gong)分4行(xing)，第(di)一(yi)行(xing)為以該(gai)基因的(de)(de)注釋文(wen)件作出的(de)(de)基因模(mo)型，第(di)二行(xing)為根據(ju)測(ce)(ce)序結果(guo)與(yu)注釋文(wen)件共(gong)同(tong)作出的(de)(de)基因模(mo)型，第(di)三行(xing)也是根據(ju)測(ce)(ce)序結果(guo)與(yu)注釋文(wen)件共(gong)同(tong)作出的(de)(de)基因模(mo)型，與(yu)第(di)二行(xing)不同(tong)的(de)(de)是只(zhi)是畫出具有代表性的(de)(de)isoform，第(di)四(si)行(xing)則是測(ce)(ce)序文(wen)件中(zhong)支持各外顯子(zi)的(de)(de)reads數(shu)目(mu)。
灰色(se)的(de)(de)五邊形代(dai)表(biao)(biao)外(wai)顯子(zi)，它們之(zhi)間的(de)(de)連線表(biao)(biao)示不同(tong)的(de)(de)剪(jian)接(jie)方式。紫色(se)背(bei)景表(biao)(biao)示有外(wai)顯子(zi)出現(xian)的(de)(de)區域（這其中(zhong)包括保留的(de)(de)內含(han)(han)(han)子(zi)），白色(se)背(bei)景表(biao)(biao)示沒(mei)有外(wai)顯子(zi)出現(xian)的(de)(de)區域（即(ji)內含(han)(han)(han)子(zi)區域）。圖中(zhong)白色(se)背(bei)景的(de)(de)寬度并(bing)不代(dai)表(biao)(biao)真(zhen)實(shi)的(de)(de)內含(han)(han)(han)子(zi)長度，由(you)于有的(de)(de)基因(yin)內含(han)(han)(han)子(zi)區域遠(yuan)比外(wai)顯子(zi)區域長，為了更清楚(chu)地展示可變(bian)剪(jian)切模型(xing)，內含(han)(han)(han)子(zi)區域會被縮短很多。
SpliceGrapher可(ke)以(yi)預測(ce)出(chu)多(duo)種多(duo)樣的(de)(de)可(ke)變(bian)剪切事(shi)件，已(yi)知的(de)(de)基因(yin)模型中(zhong)存在Alt 3’（可(ke)變(bian)3’端）、Skipped Exon（跳過外(wai)顯(xian)子(zi)）、Intron Retention（內(nei)含子(zi)保留）、Alt 5’（可(ke)變(bian)5’端）、既是Alt 3’又是Skipped Exon、既是Alt 5’又是Intron Retention等多(duo)種可(ke)變(bian)剪切事(shi)件。不(bu)同(tong)的(de)(de)事(shi)件用不(bu)同(tong)的(de)(de)顏色標注出(chu)來，并在圖片下方的(de)(de)圖例中(zhong)給(gei)予解釋。
SpliceGrapher預測(ce)出(chu)的可(ke)變剪(jian)切模(mo)型(xing)可(ke)能會與已知的基(ji)因模(mo)型(xing)不(bu)同，如下(xia)圖，根據測(ce)序結果預測(ce)出(chu)的基(ji)因模(mo)型(xing)比已知的基(ji)因模(mo)型(xing)多(duo)了一個外顯子，橫跨(kua)第6、7個外顯子區域(yu)和第6個內含(han)子區域(yu)。這一點從Read Coverage上也能看出(chu)來，在第6個內含(han)子區域(yu)有不(bu)少(shao)reads覆蓋度。這也許是一個從未(wei)被發(fa)現的exon。
好(hao)了(le)，關于SpliceGrapher的(de)介(jie)紹就到這里了(le)。歡迎(ying)大家訂購本公司的(de)全長有(you)參轉錄組分析產品，我們(men)的(de)可變(bian)剪(jian)切預測項目中會為大家畫出物種所有(you)的(de)基(ji)因可變(bian)剪(jian)切模型，并進行(xing)分類梳理(li)。
