2025-05-08
Highlights
4種擬時序分析的差異：
monocle2：識別細胞分(fen)化路(lu)徑及關鍵(jian)基(ji)因模塊，適合簡單(dan)線(xian)性或分(fen)支軌跡，計算效率高。
monocle3：基(ji)于UMAP降維的分(fen)支(zhi)軌(gui)跡分(fen)析，支(zhi)持非線性軌(gui)跡和大規(gui)模數(shu)據，分(fen)支(zhi)分(fen)辨率更(geng)高。
Cytotrace：評估細胞分化(hua)(hua)水平，預測細胞分化(hua)(hua)的相對狀態和(he)方(fang)向，無需先驗經驗，適(shi)合探索(suo)性分化(hua)(hua)研(yan)究。
RNA velocity：結合剪接動力學預測細(xi)(xi)胞未來狀態，揭示細(xi)(xi)胞命(ming)運的時(shi)間箭(jian)頭(tou)。
擬時序分(fen)析可用于理解細胞(bao)在不同(tong)功能狀(zhuang)態之(zhi)間的(de)(de)轉變，預測細胞(bao)的(de)(de)分(fen)化(hua)及發育(yu)軌跡(ji)，根據軌跡(ji)分(fen)布(bu)和(he)特征基因(yin)的(de)(de)表(biao)達變化(hua)來確認分(fen)化(hua)起點和(he)終點。
擬時序分析的各類軟(ruan)件之間有什么區別，適合什么場景呢？下面(mian)我們(men)來詳細(xi)解釋。monocle2和monocle3是(shi)最(zui)常用的兩種方法，因此(ci)詳細(xi)介紹。
一、monocle2
原(yuan)理：類似(si)(si)機器(qi)學習的(de)方法，根據(ju)(ju)輸入(ru)數(shu)據(ju)(ju)的(de)特(te)征基因(yin)(yin)(yin)構(gou)建軌跡(ji)樹，細(xi)胞在(zai)樹中的(de)路徑反映分(fen)(fen)化(hua)(hua)(hua)過程。之后優化(hua)(hua)(hua)細(xi)胞在(zai)低維空間中的(de)位置，同時(shi)考慮細(xi)胞間的(de)相似(si)(si)性，形成分(fen)(fen)化(hua)(hua)(hua)的(de)軌跡(ji),篩選隨時(shi)間變化(hua)(hua)(hua)的(de)基因(yin)(yin)(yin)模(mo)塊，幫助識(shi)別驅(qu)動分(fen)(fen)化(hua)(hua)(hua)的(de)基因(yin)(yin)(yin)。
輸(shu)入文件：RDS
分析流(liu)程：
1. 用帶有注釋信息的RDS，構建CellDataSet（CDS）對象(xiang)。
2. 提取用于分(fen)析的基(ji)因：
基于monocle的dispersionTable選(xuan)擇高可(ke)變基因：默認篩選(xuan)條件為平(ping)均表達量>0.1。
另外(wai)還有(you)基于(yu)differentialGeneTest的方(fang)法(fa)、基于(yu)seurat選擇高(gao)變基因的方(fang)法(fa)以及基于(yu)seurat中(zhong)FindAllMarkers方(fang)法(fa)，可以根(gen)據需求(qiu)自行選擇。
3.降維：
reduceDimension函數利用DDRTree降(jiang)維(wei)算法將高維(wei)的(de)單(dan)細胞(bao)基因表(biao)達數據映射(she)到低維(wei)空間(jian)，便于(yu)推斷細胞(bao)的(de)發育軌跡或分化路徑。
4.計算細胞擬時間
orderCells函數用于構建細胞軌(gui)跡的線性(xing)或分(fen)支(zhi)結構、生(sheng)成偽時間等，默(mo)認根是State 1（“State”是Monocle用來表示軌(gui)跡樹分(fen)支(zhi)的術語），可以使用root_state 指定根節點。
5.軌跡圖展示
參數color_by 用于(yu)指(zhi)定根據哪個變量（如細(xi)胞類型、偽時間、狀態等）對細(xi)胞進行著色。
6.基因可視化
plot_genes_in_pseudotime函數用于分支分析中基(ji)因表(biao)達的(de)可視化(hua)，展示基(ji)因在分支點的(de)表(biao)達差(cha)異
輸出結果：
應用場(chang)景：
發育生(sheng)物學：研(yan)究胚胎或器官發育中的細胞命運決定(ding)（如造血系統分化）
疾(ji)病機(ji)制：解析腫瘤演(yan)進軌(gui)跡，識別惡性轉(zhuan)化中的關(guan)鍵基因
二(er)、Monocle3
原理：用UMAP將細胞投(tou)影到低維空間，然后采用分區(qu)圖抽象的方法，構建一個最近鄰(lin)圖，通過尋找圖中的最長路徑來識別分化軌跡。
輸入文件：RDS
分析流(liu)程：
1. 用帶有注釋(shi)信息的(de)RDS，構建CDS對象。
2. 降(jiang)維，導入umap坐(zuo)標，聚類(lei)分(fen)群
reduceDimension函數使(shi)用(yong) PCA 對高維(wei)數據進(jin)行預(yu)處理，之(zhi)后使(shi)用(yong)UMAP進(jin)行降維(wei)聚類分群。然后從RDS里導入umap坐標，使(shi)monocle3的(de)結果與之(zhi)前大類注釋的(de)結果一(yi)致。
3. 軌(gui)跡推(tui)斷與細胞排序(xu)
learn_graph函數根據降維后的數據，學習細(xi)胞(bao)之間的鄰接關系，并構建graph，反映(ying)細(xi)胞(bao)在發(fa)育或分化過(guo)程中的潛在路徑。root_cells指定根節點
4. 擬(ni)時(shi)軌(gui)跡(ji)差異分析
（1）尋找擬時軌跡差異基因(yin)
graph_test函數(shu)用于識別沿細胞發育軌跡變化的基(ji)因(yin)，并通過計(ji)算莫蘭指數(shu)來評估這些基(ji)因(yin)在細胞群(qun)體中的空間自(zi)相關性。
莫蘭指數(shu)（morans_I），值在(zai)-1至1之間，0代表(biao)此基因(yin)沒(mei)有空(kong)間共表(biao)達效應，1代表(biao)此基因(yin)在(zai)空(kong)間距離相近的細胞中(zhong)表(biao)達值高度相似。
（2）挑選(xuan)top基(ji)因畫圖展示
Trace_genes_sig函數(shu)篩選(xuan)出(chu)空間自相關性（由莫蘭(lan)指數(shu)衡量）最強的前10個(ge)基因，進行后續的分析或(huo)可視化。
（3）繪制基因表達(da)趨勢圖
plot_genes_in_pseudotime函數用(yong)于(yu)分支(zhi)分析中(zhong)基因(yin)表(biao)達(da)的(de)可視化，展示基因(yin)在分支(zhi)點的(de)表(biao)達(da)差(cha)異，篩(shai)選(xuan)表(biao)達(da)量大于(yu)0.5的(de)基因(yin)。
（4）尋找共(gong)表達模(mo)塊
find_gene_modules()、aggregate_gene_expression()等函數從基(ji)(ji)因(yin)表達數據中(zhong)提取(qu)特定基(ji)(ji)因(yin)、進行(xing)模塊(kuai)檢測(ce)、按細胞組聚(ju)合基(ji)(ji)因(yin)表達數據并最終(zhong)生(sheng)成熱圖以可(ke)視化基(ji)(ji)因(yin)表達模式
輸出結果：
應用(yong)場景：
復雜系統分化：研究具有多分支路徑的細(xi)胞命運選擇
大規模數據(ju)：處理大樣(yang)本量(liang)數據(ju)
與monocle2相比，monocle3的優(you)勢：
從UMAP圖識別發育軌跡，可以繼承Seurat的(de)質(zhi)控、批(pi)次校正(zheng)和(he)(he)降維分析(xi)(xi)結果，實現(xian)“一張圖”展現(xian)細胞的(de)聚(ju)類(lei)、鑒(jian)定和(he)(he)軌跡分析(xi)(xi)結果。自動對UMAP圖分區（partition），可以選擇多(duo)個起點，軌跡分析(xi)(xi)算(suan)法的(de)邏(luo)輯更(geng)符合(he)生物學現(xian)實。
三、Cytotrace
原理：
通過量化(hua)基因表(biao)達的(de)隨機波(bo)動來(lai)推斷細胞(bao)的(de)分(fen)化(hua)狀態，其(qi)核心假設是：未分(fen)化(hua)的(de)干細胞(bao)或祖細胞(bao)具有更高的(de)表(biao)達噪聲，以維持其(qi)多(duo)潛能性；而分(fen)化(hua)細胞(bao)因功(gong)能特(te)化(hua)，表(biao)達模(mo)式(shi)更穩定(ding)。
輸出結果(guo)：
四、RNA velocity
原理：
通過量(liang)化(hua)每個細(xi)胞中未(wei)剪切mrna和(he)剪切mRNA的(de)豐度，推測基因轉(zhuan)錄(lu)速率和(he)斜率參數，因此Velocity可在(zai)不知發(fa)育過程的(de)前提(ti)下，預測譜系(xi)的(de)方向。
輸出結果(guo)：
應(ying)用場景：
動態過程(cheng)解析：研究組織中的細胞遷移(yi)方向(xiang)
軌(gui)跡(ji)驗證(zheng)：為Monocle推斷的軌(gui)跡(ji)提供方向性證(zheng)據
瞬時狀態(tai)捕(bu)捉(zhuo)：分析穩態(tai)組織中緩慢變化(hua)的細胞過程
