2025-06-09
目錄
一、云平臺重要文件下載
二、云平臺結果調整
三、篩選基因分析繪圖
四、常見問題解答
老師們做完轉錄組（真核有參、原核）后，對分析結果不清楚的話，可以直接在項目概況里點擊云平臺材料方法和結果查看指南，里面有報告解(jie)(jie)讀視頻(pin)、結果查看介紹、材料(liao)方法，方便老師們對分(fen)析(xi)結果的理解(jie)(jie)掌握。
一、云平臺重要文件下載
1、所有標準分析結果的下(xia)(xia)(xia)載(zai)：登錄賬號(hao)后，點(dian)擊(ji)項(xiang)(xiang)(xiang)目中心，在左側項(xiang)(xiang)(xiang)目列表(biao)下(xia)(xia)(xia)，點(dian)擊(ji)云分析；在項(xiang)(xiang)(xiang)目列表(biao)中找(zhao)到本次轉(zhuan)錄組項(xiang)(xiang)(xiang)目，點(dian)擊(ji)項(xiang)(xiang)(xiang)目編號(hao)進(jin)入項(xiang)(xiang)(xiang)目結(jie)(jie)果，點(dian)擊(ji)下(xia)(xia)(xia)方Result.tar.gz下(xia)(xia)(xia)載(zai)按(an)鍵(jian)，打包下(xia)(xia)(xia)載(zai)整套(tao)分析結(jie)(jie)果。
2、基因注釋表下(xia)載（Annotation.xls，包(bao)括(kuo)基因ID、染色體、起始終止位置、正負(fu)鏈、外(wai)顯(xian)子(zi)長度、基因name、各個(ge)數據(ju)庫的注釋）：項目(mu)概況→參(can)考基因組→點(dian)擊(ji)下(xia)載。
3、表達量結果下載（Expression_with_annotation.xls，包括表達(da)量(liang)和注釋）：表達(da)量(liang)分析→表達(da)量(liang)分析→表→下載表格(ge)文件。
4、差異分析結果下載（上下調基因詳細(xi)信息，XX_vs_XX.DEseq2.xls，包括差(cha)異和注(zhu)釋(shi)）：表(biao)(biao)達(da)差(cha)異分析→差(cha)異表(biao)(biao)達(da)結(jie)果統計→表(biao)(biao)→DEG_results.tar.gz。
下(xia)載的(de)文(wen)件(jian)(jian)為gz格式壓(ya)縮包，里面有各個(ge)比較組的(de)差(cha)異總表(biao)。如果解壓(ya)軟件(jian)(jian)打開不了(le)gz壓(ya)縮包的(de)話，可以下(xia)載安(an)裝(zhuang)bandizip（//www.bandisoft.com/bandizip/）解壓(ya)軟件(jian)(jian)。
5、差異基因在各組中的情況（diff_gene_of_all_groups.xls，包括基因ID和(he)不同(tong)比較(jiao)組(zu)的up/down、log2FC、p值(zhi)；需要(yao)加(jia)(jia)上注釋(shi)信息(xi)可以用excel的vlookup函數在Annotation.xls里查找(zhao)添(tian)加(jia)(jia)）：表達差異分析(xi)→差異基因韋(wei)恩圖→表→下(xia)載表格文(wen)件(jian)。
Vlookup 函(han)數(shu)應(ying)用方法(fa)：干貨 | EXCEL小技(ji)巧助力轉錄(lu)組數(shu)據挖掘(jue)
6、GO富集總表（**_vs_**_GO_download_enrichment.xls）：富集(ji)分(fen)析(xi)→GO富集(ji)分(fen)析(xi)→表→下載表格文(wen)件。
下載的(de)文件為Download_table.tar.gz壓縮包，里面是(shi)各個比較(jiao)組的(de)富集總表。
7、KEGG富集總表（**_vs_**_KEGG_download_enrichment.xls）：富(fu)集分(fen)(fen)析(xi)→KEGG富(fu)集分(fen)(fen)析(xi)→表→下載表格文件(jian)。
下載的(de)文件為(wei)Download_table.tar.gz壓縮包，里面是各(ge)個比較組(zu)的(de)富集總表。
二、云平臺結果調整
需要對分析結果進行調整的話，老師可以數據集里批量設置。數據集的使用也可以直接在項目概況里點擊云平臺材料方法和結果查看指南，查看里(li)面的(de)數據集創建&數據集管(guan)理部分(fen)。
1、剔除離群樣本：
2、調整差異篩選標準：
3、調整分組、比較組：
分(fen)(fen)析完(wan)成(cheng)后（數據集(ji)管理里可以(yi)看是否運行完(wan)成(cheng)），在各(ge)部分(fen)(fen)（2里勾選的分(fen)(fen)析）的 數據集(ji) 里選擇新命(ming)名的數據集(ji)就可以(yi)展示新的分(fen)(fen)析結(jie)果了。
三、篩選基因分析繪圖
針對部分篩選出來的目(mu)標基(ji)因（可以(yi)通(tong)過venn圖篩選多個比較組共有(you)(you)、特有(you)(you)差異基(ji)因；可以(yi)根據(ju)富集(ji)結果篩選關注通(tong)路上的差異基(ji)因等(deng)），老師可以(yi)通(tong)過數據(ju)集(ji)里(li)上傳基(ji)因列(lie)表的方式去分析(xi)。
四、常見問題解答
1、為什么分析不能直接用基因name去分析呢？
答：因為基(ji)因name并不是所有(you)(you)基(ji)因都有(you)(you)的(de)，有(you)(you)些基(ji)因是沒有(you)(you)name注(zhu)(zhu)釋(shi)的(de)，有(you)(you)些基(ji)因的(de)name有(you)(you)重名(ming)的(de)情況（以下圖ensembl數據庫里人的(de)基(ji)因組(zu)注(zhu)(zhu)釋(shi)為參考），因此分析都是用唯一且都有(you)(you)的(de)基(ji)因ID進行的(de)。我們在分析結果的(de)注(zhu)(zhu)釋(shi)、表(biao)達、差異表(biao)中都加上了基(ji)因ID和基(ji)因組(zu)里注(zhu)(zhu)釋(shi)的(de)Name的(de)對應關系，可以直接(jie)在這(zhe)3個表(biao)里查(cha)看。
2、表達量表格中的read count和FPKM有什么區別，需要看哪個呢？
答：read count是(shi)比對到基(ji)因(yin)上Reads的數(shu)量，作為基(ji)因(yin)的原(yuan)始表達量；FPKM是(shi)基(ji)于(yu)測序深(shen)度(du)(du)和(he)基(ji)因(yin)長度(du)(du)對read count標準(zhun)化后(hou)的表達量結果(guo)。一般(ban)描述基(ji)因(yin)表達量（如繪(hui)制(zhi)熱圖(tu)）用FPKM；read count主要是(shi)用于(yu)差異(yi)分(fen)析（因(yin)為差異(yi)軟(ruan)件自己也會進行(xing)標準(zhun)化，所以不能用FPKM做差異(yi)分(fen)析）。
3、組內重復性從哪里來看呢？
答：在(zai)(zai)我們分(fen)(fen)析(xi)(xi)中(zhong)PCA、相關(guan)性(xing)分(fen)(fen)析(xi)(xi)、聚(ju)類(lei)(lei)熱(re)圖(tu)這三者(zhe)都是一定程度反映樣(yang)(yang)品(pin)重復性(xing)。其(qi)中(zhong)PCA是通過線性(xing)變(bian)換，將高維數(shu)(shu)據降(jiang)低至二維或三維，同(tong)時保持各方(fang)差貢獻最(zui)大的特征（即降(jiang)低數(shu)(shu)據復雜度），進而進行的主成分(fen)(fen)分(fen)(fen)析(xi)(xi)；相關(guan)性(xing)分(fen)(fen)析(xi)(xi)是基于(yu)樣(yang)(yang)品(pin)里(li)所有基因(yin)的表達量(liang)去(qu)計算樣(yang)(yang)品(pin)之間的皮爾(er)遜相關(guan)系數(shu)(shu)；聚(ju)類(lei)(lei)熱(re)圖(tu)是基于(yu)所有比較組差異基因(yin)并集(ji)在(zai)(zai)樣(yang)(yang)品(pin)里(li)的表達量(liang)去(qu)繪制(zhi)的雙向聚(ju)類(lei)(lei)熱(re)圖(tu)。三者(zhe)針對的數(shu)(shu)據源不一樣(yang)(yang)，一般情況下可以選擇其(qi)中(zhong)一者(zhe)在(zai)(zai)文(wen)章中(zhong)展示。
4、聚類分析里分的9類是什么意思，這9類有什么功能呢？
答：是基(ji)于差異基(ji)因并集在樣品里的(de)表達量情(qing)況，劃分(fen)為9個cluster，每個cluster里的(de)基(ji)因表達模式相近。也可以(yi)在分(fen)析(xi)設置(zhi)里自定義需要劃分(fen)的(de)cluster數量，去重新運行(xing)。需要對(dui)cluster里的(de)基(ji)因做功能(neng)分(fen)析(xi)的(de)話，可以(yi)到(dao)高(gao)級分(fen)析(xi)的(de)熱圖+富(fu)集詞條圖里去查看。
5、為啥富集圖里的功能和我關注的不一樣？
答：富(fu)集分析(xi)默(mo)認是展示(shi)顯著性top20 GO term或KEGG通路(lu)的(de)(de)(de)，但是本身來說可(ke)能富(fu)集到的(de)(de)(de)通路(lu)會更多的(de)(de)(de)，老(lao)師可(ke)以下載富(fu)集表格，在表格里(li)篩選下關注(zhu)的(de)(de)(de)通路(lu)，看對(dui)應的(de)(de)(de)富(fu)集情況(kuang)。然后可(ke)以在數(shu)據過(guo)濾里(li)針對(dui)關注(zhu)的(de)(de)(de)通路(lu)，去自定義(yi)繪圖。
6、富集分析和GSEA分析有什么區別呢？
答：富集(ji)分析(xi)(xi)是(shi)針對比較組(zu)里(li)的(de)差(cha)異(yi)基因，去分析(xi)(xi)這些(xie)差(cha)異(yi)基因在GO term或KEGG pathway里(li)的(de)富集(ji)顯著性；GSEA（基因集(ji)富集(ji)）分析(xi)(xi)是(shi)一(yi)種計算方(fang)法(fa)(fa)，不需要指定明確的(de)差(cha)異(yi)基因閾值，把所有基因按照在兩(liang)組(zu)樣(yang)本(ben)中的(de)差(cha)異(yi)表(biao)達程度進行(xing)排(pai)序(xu)，然后采用統計學方(fang)法(fa)(fa)檢(jian)驗預(yu)先設定的(de)基因集(ji)合是(shi)否在排(pai)序(xu)表(biao)的(de)頂端或低(di)段富集(ji)。
富集分析(xi)側重的(de)是差異基因在通(tong)路(lu)的(de)富集顯著性；GSEA側重這條通(tong)路(lu)整體是被激(ji)活還是抑制的(de)。兩者(zhe)可(ke)以(yi)結(jie)合著使(shi)用，也(ye)可(ke)以(yi)只展示其中一者(zhe)結(jie)果。
7、GSEA結果怎么看呢？
答：GSEA主要(yao)看(kan)富集圖(tu)：第一(yi)部分(fen)是(shi)(shi)(shi)通路(lu)(lu)里(li)所(suo)有基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)對(dui)(dui)應的(de)(de)(de)ES值的(de)(de)(de)分(fen)布曲線，最高峰(feng)處的(de)(de)(de)得分(fen)（垂(chui)直距離0.0最遠）便是(shi)(shi)(shi)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)集的(de)(de)(de)ES值；第二部分(fen)是(shi)(shi)(shi)用線條標記(ji)了(le)對(dui)(dui)應通路(lu)(lu)中基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)出現(xian)在(zai)排(pai)序列(lie)表中的(de)(de)(de)位置，每條豎(shu)線代表該通路(lu)(lu)的(de)(de)(de)一(yi)個(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)；第三部分(fen)是(shi)(shi)(shi)所(suo)有基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)排(pai)序后分(fen)布情況，其(qi)中紅色部分(fen)對(dui)(dui)應的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)處理組(zu)中高表達(da)，藍色部分(fen)對(dui)(dui)應的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)在(zai)對(dui)(dui)照組(zu)中高表達(da)。一(yi)般認為(wei)|NES|>1，NOM p-val<0.05，FDR q-val<0.25的(de)(de)(de)通路(lu)(lu)是(shi)(shi)(shi)顯著富集的(de)(de)(de)。其(qi)中NES正(zheng)值代表這個(ge)通路(lu)(lu)在(zai)這個(ge)比較(jiao)組(zu)中是(shi)(shi)(shi)激活的(de)(de)(de)，NES負值代表這個(ge)通路(lu)(lu)在(zai)比較(jiao)組(zu)中是(shi)(shi)(shi)被抑制的(de)(de)(de)。
