2025-06-13
Highlights
1、本(ben)文解析抗(kang)體試(shi)劑在(zai) WB 實驗中的(de)應(ying)用，涵蓋(gai)從明確目標、匹配物(wu)種到一(yi)抗(kang)二抗(kang)配合(he)的(de)選(xuan)擇要點(dian)。
2、闡述抗體(ti)儲存分裝(zhuang)、精準(zhun)稀釋及孵育(yu)條件優化等使用核心細節。
3、列舉(ju)背景(jing)高、無條帶、條帶位(wei)置(zhi)異(yi)常(chang)等常(chang)見問題(ti)及對(dui)應解決對(dui)策。
在蛋白質研(yan)究領域，Western Blot（WB）實(shi)驗是分析蛋白質表(biao)達(da)與(yu)特(te)性(xing)的經(jing)典技術(shu)。而抗(kang)體試(shi)劑作為 WB 實(shi)驗的 “靈魂探針”，其質量與(yu)使用(yong)方(fang)法(fa)直接決定實(shi)驗成敗。今天就帶大家深(shen)入了(le)解抗(kang)體試(shi)劑在 WB 實(shi)驗中的應用(yong)要點(dian)，從抗(kang)體匹配到常見問題規避(bi)，一文講透！
一、精準匹配：找到 WB 實驗的 “最佳拍檔”
1. 明確實驗目標
在選擇(ze)抗(kang)體前(qian)，必須清晰界定(ding)實驗目(mu)(mu)的(de)(de)：是檢測特(te)定(ding)蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)表達(da)量，還(huan)是分(fen)析蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)修飾(shi)狀態（如磷酸化、乙(yi)酰化）？不(bu)(bu)同(tong)目(mu)(mu)標對應(ying)不(bu)(bu)同(tong)類型的(de)(de)抗(kang)體，例如檢測總蛋(dan)(dan)白(bai)表達(da)可用特(te)異性識別(bie)蛋(dan)(dan)白(bai)全長的(de)(de)一抗(kang)，而研究蛋(dan)(dan)白(bai)修飾(shi)則(ze)需選擇(ze)修飾(shi)位(wei)點特(te)異性抗(kang)體。
2. 物種與應用驗證
抗體說明書中的(de) “應用驗證(zheng)” 欄是關鍵參考。確保(bao)所(suo)選抗體標注(zhu)適用于(yu) WB 實驗，并與(yu)樣本物(wu)種匹配。例如，研(yan)究小鼠樣本時，需(xu)選擇 “適用于(yu)小鼠” 的(de)抗體，避免因種屬交(jiao)叉(cha)反應不足導致(zhi)的(de)假(jia)陰性結(jie)果(guo)。
3. 一抗與二抗的 “默契配合”
一抗(kang)(kang)特異性識別目標蛋白，二(er)抗(kang)(kang)則結合一抗(kang)(kang)實現信號放大(da)。二(er)抗(kang)(kang)需針對(dui)一抗(kang)(kang)來(lai)源(yuan)物(wu)種(zhong)（如兔(tu)抗(kang)(kang)、鼠抗(kang)(kang)）和標記(ji)物(wu)（HRP、熒(ying)光(guang)(guang)素）進行選擇(ze)(ze)。例如，使用兔(tu)源(yuan)一抗(kang)(kang)時，應搭(da)配抗(kang)(kang)兔(tu)二(er)抗(kang)(kang)，并根(gen)據檢測方法(fa)選擇(ze)(ze) HRP 標記(ji)（化(hua)學發光(guang)(guang)法(fa)）或(huo)熒(ying)光(guang)(guang)標記(ji)（熒(ying)光(guang)(guang)成像法(fa)）。
二、細節把控：抗體使用的核心要點
1. 正確的儲存與分裝
抗體通常需(xu) -20℃ 或(huo) -80℃ 凍存，避免(mian)反復凍融。收到抗體后，根據實驗用量分(fen)裝成小份(fen)，每次使用取用一(yi)份(fen)，減少(shao)效(xiao)價損失。液體抗體在 4℃短期保存時，需(xu)添加疊氮化(hua)鈉等防腐劑防止污染。
2. 精準稀釋，避免浪費
嚴格按照說(shuo)明書推(tui)薦(jian)的稀釋(shi)比(bi)例配制工作液，過度(du)稀釋(shi)可(ke)能導致(zhi)信號減弱(ruo)，而濃度(du)過高則(ze)會產生(sheng)非特(te)異(yi)性條(tiao)帶(dai)。首次實驗(yan)建議(yi)設(she)置梯度(du)稀釋(shi)（如 1:500、1:1000、1:2000），摸(mo)索最(zui)佳濃度(du)。
3. 孵育條件優化
一(yi)抗孵(fu)(fu)育(yu)溫度和(he)時(shi)間需根據抗體特性調整：4℃過夜孵(fu)(fu)育(yu)可增(zeng)強結(jie)合特異性，而室溫孵(fu)(fu)育(yu) 1-2 小(xiao)時(shi)則更適(shi)合快速(su)實(shi)驗(yan)。二抗孵(fu)(fu)育(yu)時(shi)需避光(guang)（熒光(guang)標記），并確保搖(yao)床轉(zhuan)速(su)適(shi)中，避免抗體分布不均(jun)。
三、避坑指南：常見問題與解決方案
1. 背景高、條帶雜
原因：抗體濃度過(guo)高(gao)、封閉不(bu)充(chong)分(fen)、洗膜不(bu)徹底。
對策：降低抗體稀釋度(du)，延長封閉時(shi)間（如用(yong) 5% 脫脂牛奶封閉 1 小時(shi)），增(zeng)加洗(xi)膜(mo)次數（5 次 ×10 分鐘(zhong)）。
2. 無條帶或條帶弱
原因：抗體特異(yi)性不足、樣(yang)本蛋白(bai)表達低、轉(zhuan)膜效率差。
對策：更換驗證更充分的抗體，增加上樣量，優化轉膜條件(jian)（如調整電流、時(shi)間）。
3. 條帶位置異常
原因：抗體識別非(fei)特異性(xing)表位、蛋白發生降(jiang)解或(huo)修飾(shi)。
對策：選擇單克(ke)隆抗(kang)體(ti)或經過敲低驗證(zheng)的抗(kang)體(ti)，使(shi)用蛋白酶 / 磷酸酶抑制(zhi)劑保護樣本。
結 語
抗體(ti)試(shi)劑的(de)正確使用是 WB 實(shi)(shi)驗(yan)(yan)成(cheng)功的(de)基石。從精準匹配到(dao)細節(jie)把控，再到(dao)問題排(pai)查，每個環(huan)節(jie)都需嚴謹對待。如果(guo)你在(zai)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)中遇到(dao)其他(ta)困惑，歡迎在(zai)評論(lun)區(qu)留言交流，或分享你的(de)獨家(jia)(jia)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)技巧！派森諾竭(jie)誠為大家(jia)(jia)提供國內外(wai)品牌抗體(ti)，助力每一位生(sheng)命科學(xue)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)的(de)科研人收獲屬于自己的(de)完(wan)美實(shi)(shi)驗(yan)(yan)結果(guo)，逐夢高分文(wen)章(zhang)~
