研究物種：艾

發表(biao)期刊：Plant Biotechnology

發表時間：2022年6月

影響(xiang)因子：9.803

研究背景

艾與青蒿同(tong)樣(yang)著名，是(shi)蒿屬(shu)中具有(you)巨大經濟價值的藥用植物(wu)，蒿屬(shu)是(shi)菊科中的一個(ge)(ge)大的植物(wu)屬(shu)，包(bao)括大約500個(ge)(ge)物(wu)種(zhong)和(he)亞種(zhong)，主要(yao)分(fen)布在北半球(qiu)溫帶地區，被廣泛用于藥草(cao)、食(shi)品(pin)、化妝品(pin)、香料、草(cao)料和(he)觀賞(shang)植物(wu)等(deng)各個(ge)(ge)領(ling)域。2015年，從青蒿中分(fen)離(li)出的抗瘧成(cheng)分(fen)青蒿素的發現獲得諾貝爾生理學或(huo)醫學獎(jiang)，引起全球(qiu)關注青蒿屬(shu)其他(ta)物(wu)種(zhong)的研究。

細胞遺傳學研(yan)究(jiu)促進(jin)了對蒿(hao)屬內物(wu)種的(de)系統分類(lei)(lei)和進(jin)化(hua)關系的(de)認知，但染(ran)色體融合在蒿(hao)屬基本染(ran)色體數目變異中的(de)作用尚未得到充分驗證。藥理學研(yan)究(jiu)表明(ming)，艾(ai)表現出抗(kang)(kang)炎(yan)作用、抗(kang)(kang)過敏、抗(kang)(kang)菌的(de)、抗(kang)(kang)氧化(hua)劑和抗(kang)(kang)癌等活性，是由于其葉(xie)片中含有大量的(de)次級代謝產物(wu)，包括揮發油、黃酮類(lei)(lei)、萜類(lei)(lei)化(hua)合物(wu)、酚酸和其他(ta)化(hua)合物(wu)。

然(ran)而(er)，由于缺乏艾(ai)高質量(liang)的(de)參考(kao)基因組，艾(ai)的(de)進(jin)化和(he)大量(liang)活性(xing)成分的(de)生物(wu)合成的(de)分子基礎很少(shao)被報道，將為探索艾(ai)和(he)其他蒿(hao)屬植物(wu)的(de)遺傳和(he)進(jin)化生物(wu)學提供寶貴的(de)資(zi)源。

研究方法

基于Illumina、PacBio HiFi測序和Hi-C相結合(he)完成(cheng)了艾基因組的組裝和注釋；后續進(jin)行了比較基因組學、轉(zhuan)錄組學、代謝組等的聯(lian)合(he)分析。

研(yan)究結果

結果1、艾(ai)基因組(zu)(zu)組(zu)(zu)裝及注釋

艾(ai)(ai)染色(se)體(ti)級(ji)別(bie)的基(ji)因(yin)組(zu)組(zu)裝大(da)(da)小約(yue)為(wei)8.03 Gb，包(bao)含12,499個scaffold，N50大(da)(da)小為(wei)206.40 Mb，contig的N50大(da)(da)小為(wei)6.25 Mb（圖(tu)1），Hi-C數據掛載(zai)到34條(tiao)染色(se)體(ti)上，掛載(zai)率為(wei)91.4%。BUSCO完(wan)整度95.5%，重復序(xu)列(lie)(lie)比(bi)例73.59%。艾(ai)(ai)基(ji)因(yin)組(zu)共(gong)包(bao)括93888個基(ji)因(yin)，基(ji)因(yin)和(he)(he)編(bian)碼(ma)DNA（CDS）的平均(jun)序(xu)列(lie)(lie)長度分別(bie)為(wei)3416和(he)(he)1256 bp，每個基(ji)因(yin)平均(jun)有5個外顯子和(he)(he)4個內含子。此外，這些(xie)基(ji)因(yin)共(gong)有93.87%和(he)(he)93.98%在(zai)Nr和(he)(he)TrEMBL數據庫中被(bei)功(gong)能注釋，72.30%的基(ji)因(yin)被(bei)GO分類(lei)，31.13%的基(ji)因(yin)被(bei)注釋到KEGG通路。

表1. 艾基因組統計

結(jie)果2、艾的(de)比較基因組學(xue)分析

比(bi)較基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組分析(xi)鑒定到(dao)艾(ai)(ai)特有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)家(jia)(jia)(jia)族(zu)(zu)5321個（包含18,902個特有(you)(you)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)）。在艾(ai)(ai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組中(zhong)40.04%（11,177/27,915）的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)家(jia)(jia)(jia)族(zu)(zu)發生擴(kuo)張，14.15%（3951/27,915）的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)家(jia)(jia)(jia)族(zu)(zu)收縮（圖1B），擴(kuo)增基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)功能在結合、催化(hua)(hua)活性(xing)、光系(xi)統II中(zhong)的(de)(de)(de)(de)光合電子傳遞和(he)(he)氧化(hua)(hua)還原(yuan)酶活性(xing)方面顯(xian)著相(xiang)關。這(zhe)些基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)與植(zhi)物生長(chang)和(he)(he)脅迫反(fan)應有(you)(you)關，這(zhe)些大(da)量(liang)擴(kuo)展的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)可(ke)能有(you)(you)助于其(qi)(qi)在整(zheng)個地球(qiu)表(biao)面的(de)(de)(de)(de)成功擴(kuo)張和(he)(he)快速生長(chang)。通(tong)過單拷貝系(xi)統發育樹和(he)(he)已知化(hua)(hua)石時間估計(ji)出(chu)，艾(ai)(ai)草與青蒿在約(yue)740百(bai)(bai)萬(wan)年前分化(hua)(hua)開(kai)。WGD分析(xi)表(biao)明(ming)艾(ai)(ai)經歷了兩輪WGD（最(zui)近(jin)的(de)(de)(de)(de)WGD和(he)(he)WGT-1）事件(jian)(jian)（圖2C），最(zui)近(jin)的(de)(de)(de)(de)WGD事件(jian)(jian)發生在約(yue)2.2百(bai)(bai)萬(wan)年前，這(zhe)是一個物種特異性(xing)重復(fu)事件(jian)(jian)，沒有(you)(you)發生在短(duan)莛(ting)飛蓬、向(xiang)日葵和(he)(he)紅(hong)花的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組中(zhong)，但發生在青蒿和(he)(he)野菊。艾(ai)(ai)的(de)(de)(de)(de)WGT-1事件(jian)(jian)是與短(duan)莛(ting)飛蓬、紅(hong)花和(he)(he)其(qi)(qi)他Asterid-II植(zhi)物共享(xiang)的(de)(de)(de)(de)保(bao)守(shou)的(de)(de)(de)(de)全基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組三倍化(hua)(hua)事件(jian)(jian)（Badouin 等，2017），發生在大(da)約(yue)62.9百(bai)(bai)萬(wan)年前。最(zui)近(jin)的(de)(de)(de)(de)WGD事件(jian)(jian)和(he)(he)最(zui)近(jin)在艾(ai)(ai)中(zhong)爆發的(de)(de)(de)(de)LTR可(ke)能是其(qi)(qi)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組大(da)小(xiao)大(da)的(de)(de)(de)(de)最(zui)重要原(yuan)因(yin)(yin)(yin)之一（圖2D）。

圖2. 艾基因(yin)組組結(jie)果(guo)和比較基因(yin)組學

結果3、艾(ai)基因組的染色(se)體融(rong)合

共(gong)線性分析表明，艾的(de)(de)(de)(de)34條(tiao)(tiao)假染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)由10個(ge)(ge)同源(yuan)(yuan)(yuan)組組成，其(qi)中7個(ge)(ge)組每(mei)組有4套單倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)，3組每(mei)組有2條(tiao)(tiao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)。此(ci)外(wai)(wai)，根據(ju)基(ji)因共(gong)線性分析，1-7染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)組中的(de)(de)(de)(de)四個(ge)(ge)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)中的(de)(de)(de)(de)每(mei)一個(ge)(ge)都(dou)可以分為(wei)兩個(ge)(ge)亞組，這(zhe)(zhe)表明艾是異(yi)源(yuan)(yuan)(yuan)四倍(bei)(bei)體(ti)(ti)(ti)(ti)，該結果(guo)(guo)也與(yu)基(ji)因組調查(cha)分析的(de)(de)(de)(de)結果(guo)(guo)一致。10號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)長(chang)度幾(ji)乎是8號(hao)和(he)9號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)長(chang)度的(de)(de)(de)(de)總和(he)（圖(tu)3a），基(ji)因組內(nei)共(gong)線性分析顯(xian)示，8號(hao)和(he)9號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)與(yu)10號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)共(gong)享緊密的(de)(de)(de)(de)共(gong)線區(qu)域（圖(tu)3b）。此(ci)外(wai)(wai)，根據(ju)BLAST結果(guo)(guo)，10號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)上(shang)的(de)(de)(de)(de)11,780個(ge)(ge)（92.05%，總共(gong)12,797個(ge)(ge)）基(ji)因與(yu)8號(hao)和(he)9號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)上(shang)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因同源(yuan)(yuan)(yuan)。總之(zhi)，這(zhe)(zhe)些數據(ju)使我(wo)們能夠(gou)假設祖(zu)先的(de)(de)(de)(de)8號(hao)和(he)9號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)被(bei)融合到艾的(de)(de)(de)(de)10號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)中，并且10號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)表現(xian)為(wei)祖(zu)先8號(hao)和(he)9號(hao)染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)末(mo)端融合，伴隨通過至少(shao)一次倒位和(he)兩次染(ran)(ran)(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)(ti)內(nei)易位事件。

圖3. 10號(hao)染(ran)色(se)體(ti)與8號(hao)、9號(hao)染(ran)色(se)體(ti)之間的染(ran)色(se)體(ti)共線性模式和(he)染(ran)色(se)質結構。

結果4、參與黃酮合成(cheng)基因

采用超高效液相色譜(pu)（HPLC）對(dui)‘香艾’七種(zhong)(zhong)不(bu)同組織（根(gen)、根(gen)莖(jing)、莖(jing)和葉A-D的(de)四個不(bu)同發育階段）中的(de)這些(xie)(xie)黃(huang)(huang)酮(tong)(tong)類化(hua)合(he)(he)物進行定量(liang)。結果表明，這些(xie)(xie)生物活性(xing)黃(huang)(huang)酮(tong)(tong)類化(hua)合(he)(he)物在葉子(zi)中比在其他組織中更豐富，其中澤蘭(lan)黃(huang)(huang)醇(chun)素(su)含量(liang)最高，且隨葉片生長期而增(zeng)加。基于在其他物種(zhong)(zhong)中對(dui)黃(huang)(huang)酮(tong)(tong)的(de)廣泛研究，我們提出了這些(xie)(xie)化(hua)合(he)(he)物在艾中可能的(de)生物合(he)(he)成(cheng)途(tu)徑（圖4a,c）。

通過同源(yuan)搜索和功能(neng)注(zhu)釋(shi)，在黃酮類生物合成途徑中共鑒定出44個候(hou)選(xuan)基(ji)因(yin)共編碼12種關鍵酶，近一(yi)半的(de)(de)候(hou)選(xuan)基(ji)因(yin)屬于擴張(zhang)基(ji)因(yin)。利用來自(zi)根(gen)(gen)和葉(xie)(xie)器官的(de)(de)樣(yang)本(ben)進行轉錄組(zu)分析，以(yi)鑒定不同組(zu)織和不同發育階(jie)段(duan)的(de)(de)葉(xie)(xie)片(pian)之間(jian)的(de)(de)差異(yi)表(biao)達(da)基(ji)因(yin)。幾乎所有候(hou)選(xuan)基(ji)因(yin)都(dou)(dou)在七(qi)個選(xuan)定的(de)(de)組(zu)織中都(dou)(dou)表(biao)達(da)，但在該途徑中前四個基(ji)因(yin)的(de)(de)表(biao)達(da)水(shui)平(ping)，特別是根(gen)(gen)樣(yang)品中HCT基(ji)因(yin)的(de)(de)表(biao)達(da)水(shui)平(ping)高于葉(xie)(xie)片(pian)樣(yang)品，而下游基(ji)因(yin)，尤其是CHS基(ji)因(yin)在葉(xie)(xie)片(pian)中的(de)(de)表(biao)達(da)水(shui)平(ping)高于在根(gen)(gen)中的(de)(de)表(biao)達(da)水(shui)平(ping)（圖4b）。

使用(yong)保(bao)守結(jie)構域和(he)已報道的(de)FOMT基因(yin)家(jia)族作為參考，對(dui)艾中(zhong)的(de)FOMT基因(yin)家(jia)族進行鑒定與表(biao)達模式分析。在艾基因(yin)組中(zhong)找到83個FOMT基因(yin)，根據系統(tong)發(fa)育分析結(jie)果劃(hua)分為五個主(zhu)要亞群，包括31個3’FOMT、6個6FOMT、10個4’FOMT、32個咖啡酰(xian)CoA O-甲(jia)基轉(zhuan)移(yi)酶（CCoAOMT）和(he)四個未分類的(de)FOMT（圖(tu)4d）。

圖4. 艾黃酮生物(wu)合成相關基因的鑒定和(he)表達(da)譜。

結(jie)果5、參(can)與萜類化生物合成基因

由于含有豐(feng)富(fu)的(de)(de)萜類化合物，揮發(fa)油是艾葉中重要(yao)的(de)(de)藥效學成(cheng)分。艾葉揮發(fa)油中含有豐(feng)富(fu)的(de)(de)單萜和(he)倍半萜（圖5a）。它(ta)們都來自常見的(de)(de)前體(ti)異戊烯(xi)焦磷(lin)酸鹽(yan)（IPP）和(he)二甲(jia)基(ji)烯(xi)丙基(ji)焦磷(lin)酸鹽(yan)（DMAPP）。IPP和(he)DMAPP主要(yao)通過細胞質中的(de)(de)甲(jia)羥戊酸途(tu)徑(jing)（MVA）和(he)質體(ti)中的(de)(de)甲(jia)基(ji)赤蘚糖醇磷(lin)酸（MEP）途(tu)徑(jing)產生（Sapir-Mir et al., 2008; Vranova et al., 2013）。采用同源(yuan)搜索和(he)功能(neng)注釋的(de)(de)方法篩選(xuan)出參(can)與MVA和(he)MEP通路的(de)(de)候(hou)選(xuan)基(ji)因(yin)。結果(guo)表(biao)明，共有66個(ge)(ge)基(ji)因(yin)編碼14個(ge)(ge)基(ji)因(yin)家族(zu)，參(can)與了艾的(de)(de)這兩(liang)個(ge)(ge)途(tu)徑(jing)（圖5b）。

圖5. 艾葉(xie)中的揮發(fa)性(xing)化(hua)合物及(ji)其生(sheng)物合成途徑。

結(jie) 論

本項研究報道了蒿屬第(di)一個物(wu)(wu)種艾的(de)(de)(de)染色(se)(se)體級(ji)別(bie)的(de)(de)(de)參考基(ji)因(yin)組，基(ji)因(yin)組帶有大(da)量的(de)(de)(de)蛋(dan)白編碼基(ji)因(yin)。對(dui)艾基(ji)因(yin)組進行分析，發現(xian)艾的(de)(de)(de)3次全基(ji)因(yin)組復制(zhi)事件以及近期發生的(de)(de)(de)重(zhong)復序列的(de)(de)(de)急劇擴(kuo)(kuo)張(zhang)是(shi)導致其超大(da)基(ji)因(yin)組的(de)(de)(de)主要原(yuan)因(yin)。共線性分析結果表明，10號染色(se)(se)體就(jiu)是(shi)蒿屬祖(zu)先的(de)(de)(de)8、9號兩條染色(se)(se)體首(shou)尾相連融(rong)合(he)后的(de)(de)(de)產(chan)物(wu)(wu)。此(ci)外(wai)，光系統II中(zhong)的(de)(de)(de)PsbA基(ji)因(yin)、DNA復制(zhi)中(zhong)的(de)(de)(de)復制(zhi)因(yin)子(zi)A1（RPA1）基(ji)因(yin)、熱(re)激蛋(dan)白（HSPs）基(ji)因(yin)和(he)萜(tie)類合(he)成酶(mei)（TPS）基(ji)因(yin)極(ji)大(da)的(de)(de)(de)擴(kuo)(kuo)張(zhang)，這些(xie)基(ji)因(yin)家族的(de)(de)(de)顯著(zhu)擴(kuo)(kuo)張(zhang)可能(neng)是(shi)艾具(ju)有較強的(de)(de)(de)生態位競爭能(neng)力(li)和(he)環(huan)境(jing)適應性的(de)(de)(de)重(zhong)要基(ji)礎。此(ci)外(wai)，研究還(huan)提(ti)出了艾黃(huang)酮類化合(he)物(wu)(wu)和(he)萜(tie)類化合(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)生物(wu)(wu)合(he)成主干(gan)途徑，揭(jie)示了廣泛的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)擴(kuo)(kuo)增和(he)串聯重(zhong)復是(shi)艾黃(huang)酮類化合(he)物(wu)(wu)和(he)揮發油含量豐富的(de)(de)(de)原(yuan)因(yin)。

參考文獻

Yuhuan Miao, Dandan Luo, Tingting Zhao, et al. Genome sequencing reveals chromosome fusion and extensive expansion of genes related to secondary metabolism in Artemisia argyi. Plant Biotechnology. 2022 June 11; //doi.org/10.1111/pbi.13870