文(wen)章亮(liang)點(dian)

1.文章突破四倍體基因(yin)組組裝難題(ti)，構建首個整合433,765個結構變異（SVs）的苜蓿泛基因組，為多倍(bei)體作物研(yan)究提供新范式。

2.評估基于SNP或SV的GWAS分析方法對性狀預測的準確度，基于SV的方法使品質性狀預(yu)測準確(que)率提升至(zhi)96.63%，QTL檢出效率較SNP方法(fa)提高47%。

3.派森諾提供全基因組關聯分析(GWAS)一站(zhan)式解決方案：從樣本檢測到基因定位，專業解析復雜性狀遺傳機制，助力精準育種與醫(yi)學研究突破。

文章信息

文章題目(mu)：Pan-genomic analysis highlights genes associated with agronomic traits and enhances genomics-assisted breeding in alfalfa

中(zhong)文題目：泛基因(yin)組分析揭示(shi)紫花苜(mu)蓿農藝性狀相關基因(yin)并強(qiang)化基因(yin)組輔(fu)助(zhu)育種效能

發(fa)表期刊：Nature Genetics

影(ying)響因子：29

發表時間(jian)：2025年4月

涉及組學：基因組(zu)Denovo、全基因組(zu)測序(xu)(xu)、轉錄組(zu)測序(xu)(xu)

摘(zhai)要

苜蓿（Medicago sativa L.）是一種(zhong)全球重要的(de)牧草作(zuo)物(wu)，因(yin)其高營養價(jia)值和(he)(he)固(gu)氮能(neng)力而(er)備受(shou)重視。本研究(jiu)(jiu)基(ji)(ji)于24個(ge)遺(yi)傳(chuan)背景多(duo)樣(yang)的(de)苜(mu)蓿(xu)(xu)種(zhong)質，構建(jian)了(le)高質量泛基(ji)(ji)因(yin)組(zu)。通過(guo)全面分(fen)析，共鑒定出(chu)433,765個(ge)結構變(bian)異（SVs）和(he)(he)54,002個(ge)泛基(ji)(ji)因(yin)家族，揭示(shi)了(le)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)多(duo)樣(yang)性在苜(mu)蓿(xu)(xu)馴(xun)化和(he)(he)適(shi)應(ying)中的(de)關鍵(jian)作(zuo)用。研究(jiu)(jiu)發現與(yu)耐鹽性和(he)(he)品(pin)質性狀相關的(de)關鍵(jian)SVs，并通過(guo)功能(neng)分(fen)析驗證了(le)MsMAP65和(he)(he)MsGA3ox1等基(ji)(ji)因(yin)的(de)作(zuo)用。該文章為苜(mu)蓿(xu)(xu)育種(zhong)提供了(le)寶貴的(de)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)資(zi)源，為重要農藝(yi)性狀的(de)遺(yi)傳(chuan)基(ji)(ji)礎提供了(le)新見解，并為未來作(zuo)物(wu)改(gai)良奠定了(le)堅(jian)實基(ji)(ji)礎。

研究背(bei)景

苜蓿因其高品(pin)質、高產性、生(sheng)物(wu)固氮(dan)能力和(he)(he)抗逆性的獨特組合，在牧草(cao)作物(wu)中(zhong)意義(yi)重(zhong)(zhong)大(da)。作為歷史上重(zhong)(zhong)要(yao)的作物(wu)，經過長期(qi)(qi)馴化和(he)(he)栽培(pei)，苜蓿已演(yan)變為高產且(qie)適應性強的牧草(cao)。 此外，苜蓿與根瘤菌形成共生(sheng)關系，促進大(da)氣固氮(dan)，這不僅減少生(sheng)長期(qi)(qi)間(jian)對(dui)氮(dan)肥(fei)的依賴(lai)，還帶來經濟效益和(he)(he)環境效益。因此，苜蓿在全(quan)球(qiu)糧食供應和(he)(he)土壤(rang)修復中(zhong)扮(ban)演(yan)關鍵(jian)角色。

傳(chuan)統依賴單一參考基(ji)因組(zu)序列往(wang)往(wang)無法充分捕(bu)捉(zhuo)物種序列多樣性(xing)的(de)全貌(mao)，尤其是在(zai)(zai)復雜大片(pian)段SVs的(de)背景(jing)下(xia)。SVs在(zai)(zai)決定農藝性(xing)狀、作物馴化(hua)、遺(yi)傳(chuan)改良和進化(hua)過(guo)程中(zhong)發(fa)揮關(guan)鍵作用。在(zai)(zai)此背景(jing)下(xia)，泛基(ji)因組(zu)通(tong)過(guo)整合(he)物種內(nei)多個基(ji)因組(zu)的(de)復雜變(bian)異，為(wei)基(ji)因表征提(ti)供(gong)了更準確和全面的(de)方(fang)法。這一綜合(he)方(fang)法有望推動苜蓿(xu)的(de)可持(chi)續發(fa)展和改良，為(wei)培育更高產、適應(ying)性(xing)更強的(de)新品(pin)種提(ti)供(gong)堅實支持(chi)。

研(yan)究(jiu)結果

1.ZM4苜(mu)蓿單倍型基因(yin)組組裝改進

本研究針對(dui)同源四倍(bei)體苜蓿（2n=4x=32）基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)復雜性問題，通過(guo)創新性單倍(bei)型(xing)組(zu)裝策略(lve)，顯(xian)(xian)著提升了(le)ZM4品(pin)種的(de)(de)(de)參考基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)質量。采用Khaper算法對(dui)初(chu)始(shi)2.74 Gb的(de)(de)(de)contigs進行去冗余處理，獲得826.16 Mb的(de)(de)(de)單倍(bei)型(xing)contigs（N50=1.05 Mb），并通過(guo)Hi-C數據錨(mao)定(ding)至(zhi)8條(tiao)偽染色體（錨(mao)定(ding)率99.93%）。基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組(zu)質量評估顯(xian)(xian)示：BUSCO完整(zheng)性達(da)97.4%（1,572/1,614核心(xin)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)），長(chang)末端重復序列組(zu)裝指數（LAI=20.44）達(da)到黃金標(biao)準，且與近緣物(wu)種（M. truncatula和(he)M. sativa ssp. caerulea）的(de)(de)(de)共線(xian)性分析驗(yan)證(zheng)了(le)組(zu)裝的(de)(de)(de)準確性。

圖1 ZM4苜蓿基因組組裝(zhuang)

2.變異檢測和群體結構分析

研究人(ren)員對176份(fen)苜(mu)蓿核(he)(he)心種(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)資源進行重測序，旨在(zai)深入解析(xi)其遺(yi)(yi)傳(chuan)多樣性(xing)與群(qun)(qun)體結構。通過ADMIXTURE軟件分析(xi)全球(qiu)苜(mu)蓿遺(yi)(yi)傳(chuan)結構，采用交叉(cha)驗證誤(wu)差率評估不同(tong)亞(ya)群(qun)(qun)數(shu)量模型（K=2-9），最(zui)終確定最(zui)優(you)分組為三(san)個亞(ya)群(qun)(qun)（Group1-3）。Group1：以(yi)美(mei)國種(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)為主（占比63.2%）；Group2：以(yi)中國種(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)為主（71.8%）；Group3：以(yi)土(tu)耳其種(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)為核(he)(he)心（58.3%）。主成分分析(xi)（PCA）結果與群(qun)(qun)體結構高度一致。三(san)組間(jian)遺(yi)(yi)傳(chuan)分化指數(shu)FST為0.011-0.018，顯示：亞(ya)群(qun)(qun)間(jian)分化程度低(di)（FST<0.05）、基因(yin)流水平較高（Nm>10），種(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)交換可能維持了遺(yi)(yi)傳(chuan)相(xiang)似性(xing)。

圖(tu)2 苜蓿的群體(ti)結構特(te)征

3.組裝和注(zhu)釋24份苜蓿基因組種質

研究(jiu)人員通過對24個(ge)代(dai)表性苜蓿種質（涵蓋野生(sheng)型(xing)(xing)2個(ge)、改良品(pin)種2個(ge)、地方品(pin)種11個(ge)和(he)栽培品(pin)種9個(ge)）進行PacBio HiFi測(ce)序和(he)高質量基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)組(zu)裝，建立(li)了首個(ge)全(quan)面的苜蓿基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)資源庫(ku)。研究(jiu)獲得(de)染色(se)體水平(ping)單倍(bei)型(xing)(xing)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)（801.7-891.8 Mb），平(ping)均contig N50達1.05 Mb，BUSCO完整性93.1%，重復(fu)序列占比(bi)59.93%；預測(ce)47,587-53,837個(ge)蛋白(bai)編碼基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)/基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)，93%獲得(de)功(gong)能注釋，核心(xin)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)顯著(zhu)富集于跨膜轉運等基(ji)(ji)(ji)(ji)礎(chu)功(gong)能（P<0.05）；通過比(bi)較(jiao)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)分析發現染色(se)體間存(cun)在倒位等結構(gou)變異，為后續泛(fan)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)組(zu)研究(jiu)奠定基(ji)(ji)(ji)(ji)礎(chu)。

4.SV檢測(ce)與(yu)泛(fan)基因組構建

研究人員從24個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)苜蓿種質(zhi)中共鑒定出(chu)433,765個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)SVs，平均每個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)品種含108,441個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)變異(yi)。變異(yi)類型(xing)分(fen)布呈現(xian)顯著差異(yi)：插入（216,955個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，49.9%）和(he)缺失(shi)（185,289個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，42.7%）占主(zhu)導，而重復（23,541個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，5.4%）和(he)倒位（8,980個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)，2.1%）相對較(jiao)少。基(ji)(ji)(ji)于1,267,755個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)預測基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)模型(xing)，通過OrthoFinder聚類獲(huo)得54,002個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)非冗(rong)余基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)家族(zu)。按存(cun)在頻(pin)率劃分(fen)為：core基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)（存(cun)在于所有(you)25個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)）6,116個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)（11.3%）soft-core 基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)（存(cun)在于22-24個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)）12,697個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)（23.5%），shell基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)（2-21個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)組(zu)）33,147個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)（61.4%），以及(ji)種質(zhi)特異(yi)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)2,042個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)（3.8%）。

圖(tu)3 SV檢(jian)測(ce)與泛(fan)基因組的(de)構建

5.基于圖基因組的鹽脅迫與品質性狀變異(yi)分析(xi)

為了(le)鑒(jian)(jian)定(ding)與農(nong)藝性(xing)(xing)狀相(xiang)關(guan)(guan)(guan)的(de)(de)(de)結(jie)構變異（SVs），研究人員將短讀(du)長序(xu)列(lie)比對(dui)至基(ji)于圖形(xing)的(de)(de)(de)泛基(ji)因組，對(dui)176份苜蓿(xu)(xu)種(zhong)質資(zi)源中(zhong)的(de)(de)(de)54,649個有效(xiao)SVs進行基(ji)因分(fen)型。首先分(fen)析(xi)了(le)鹽(yan)脅(xie)迫條件下的(de)(de)(de)相(xiang)對(dui)葉(xie)長、葉(xie)寬(kuan)和葉(xie)面積(ji)，發現這些(xie)(xie)性(xing)(xing)狀間(jian)存(cun)在(zai)強相(xiang)關(guan)(guan)(guan)性(xing)(xing)（相(xiang)關(guan)(guan)(guan)系數0.73-0.92）。GWAS鑒(jian)(jian)定(ding)出與鹽(yan)脅(xie)迫下葉(xie)片性(xing)(xing)狀持(chi)續關(guan)(guan)(guan)聯(lian)的(de)(de)(de)SV，表明這些(xie)(xie)SV可能包含植(zhi)物生長和鹽(yan)脅(xie)迫形(xing)態適應的(de)(de)(de)關(guan)(guan)(guan)鍵基(ji)因。在(zai)苜蓿(xu)(xu)品質相(xiang)關(guan)(guan)(guan)遺傳性(xing)(xing)狀的(de)(de)(de)綜合研究中(zhong)，于1號染色體(ti)上鑒(jian)(jian)定(ding)到一個233 bp的(de)(de)(de)顯(xian)著SV。具體(ti)而言，該SV與單糖含量顯(xian)著相(xiang)關(guan)(guan)(guan)（P<2.44×10??），并與24小(xiao)時(shi)（P<7.50×10??）和30小(xiao)時(shi)（P<4.42×10?21）體(ti)外消(xiao)化率(lv)密切(qie)關(guan)(guan)(guan)聯(lian)，表明SV變異可能在(zai)調(diao)控苜蓿(xu)(xu)消(xiao)化率(lv)和營養價(jia)值中(zhong)起關(guan)(guan)(guan)鍵作用。

圖(tu)4 SV-GWAS關(guan)聯鹽脅迫下結構變異功能位(wei)點

基(ji)于對(dui)苜蓿品質遺傳影響的(de)(de)(de)理(li)解，研究人(ren)員聚焦另一個(ge)關(guan)鍵表型(xing)性(xing)狀——莖葉比(bi)（SLR）。在各類表型(xing)性(xing)狀中，SLR作(zuo)為(wei)植(zhi)(zhi)物莖葉相對(dui)比(bi)例的(de)(de)(de)指標(biao)，對(dui)評估植(zhi)(zhi)物結構(gou)形(xing)態和(he)生態適(shi)應(ying)性(xing)具有關(guan)鍵作(zuo)用。采(cai)用SV-GWAS方法，成(cheng)功(gong)鑒(jian)定出與SLR表型(xing)密切(qie)關(guan)聯的(de)(de)(de)SVs。在該(gai)SV上下游50 kb區域內鑒(jian)定出8個(ge)基(ji)因(yin)(yin)，為(wei)后續功(gong)能研究提供關(guan)鍵線索。具體而(er)言(yan)，分析顯(xian)示該(gai)SV位于關(guan)鍵基(ji)因(yin)(yin)GA3-氧化(hua)酶（MsGA3ox1，Msa.H.0115520）的(de)(de)(de)下游，該(gai)酶在赤霉素合(he)成(cheng)途徑中起(qi)調控(kong)作(zuo)用，對(dui)植(zhi)(zhi)物生長和(he)適(shi)應(ying)性(xing)至關(guan)重(zhong)要。為(wei)評估候選基(ji)因(yin)(yin)MsGA3ox1在苜蓿中的(de)(de)(de)作(zuo)用，研究人(ren)員構(gou)建了(le)四個(ge)獨立過表達(da)株(zhu)系（MsGA3ox1-OE）進行了(le)功(gong)能驗證(zheng)。

圖(tu)5 基(ji)于(yu)SNP-GWAS與(yu)SV-GWAS的(de)泛基(ji)因組關鍵基(ji)因功能(neng)驗(yan)證

6.圖泛基(ji)因組(zu)賦(fu)能(neng)紫花苜蓿分子育種

為了(le)(le)(le)(le)提升不同環(huan)境條(tiao)件下(xia)的(de)育(yu)種能力并更(geng)有效(xiao)地利(li)用遺傳(chuan)資源，研究(jiu)人(ren)員對(dui)54個(ge)不同表(biao)(biao)型進(jin)行了(le)(le)(le)(le)GWAS和(he)GS的(de)綜合研究(jiu)。研究(jiu)發現，與傳(chuan)統(tong)(tong)基于SNP的(de)方法相比(bi)，整合SVs的(de)GWAS效(xiao)率(lv)顯著提高，特(te)別是在(zai)某(mou)些性(xing)(xing)狀上。具體(ti)而言，47%（59個(ge)）的(de)檢測(ce)信號或數量性(xing)(xing)狀位(wei)點(dian)（QTL）是通過SV-GWAS獨特(te)鑒定的(de)。此外利(li)用SNP和(he)SV的(de)結果進(jin)行GS，預(yu)測(ce)與耐(nai)鹽性(xing)(xing)、發育(yu)性(xing)(xing)狀和(he)苜蓿品質相關的(de)表(biao)(biao)型。統(tong)(tong)計分析顯示，在(zai)預(yu)測(ce)耐(nai)鹽脅(xie)迫、發育(yu)性(xing)(xing)狀和(he)苜蓿品質表(biao)(biao)型時，SV預(yu)測(ce)的(de)準確性(xing)(xing)在(zai)大多(duo)(duo)數情(qing)況下(xia)優于基于SNP的(de)預(yu)測(ce)。這一結果進(jin)一步強調了(le)(le)(le)(le)在(zai)預(yu)測(ce)復雜性(xing)(xing)狀時考慮(lv)SVs的(de)重(zhong)要性(xing)(xing)。與傳(chuan)統(tong)(tong)SNP方法相比(bi)，SVs的(de)使用展現了(le)(le)(le)(le)更(geng)高的(de)預(yu)測(ce)準確性(xing)(xing)，為理解和(he)利(li)用遺傳(chuan)多(duo)(duo)樣性(xing)(xing)提供(gong)了(le)(le)(le)(le)新視(shi)角(jiao)。

圖6 基(ji)(ji)于SV與(yu)SNP標記(ji)的全(quan)基(ji)(ji)因組關聯分(fen)析和基(ji)(ji)因組預測準確性評估

總結

本研(yan)(yan)究針對(dui)苜蓿四倍體基(ji)因(yin)(yin)組(zu)復雜性，通過整(zheng)合(he)24個(ge)種(zhong)質(zhi)數據構(gou)建首個(ge)圖(tu)形化泛(fan)(fan)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)，鑒定(ding)出433,765個(ge)結構(gou)變異和(he)(he)54,002個(ge)泛(fan)(fan)基(ji)因(yin)(yin)家族。研(yan)(yan)究發現：耐鹽相(xiang)關SV（SV_8_28977998）調(diao)控MsMAP65基(ji)因(yin)(yin)影響葉片(pian)適(shi)應(ying)性（P<2.44×10??）；1號染色體233 bp SV與單糖含量（P<4.42×10?21）和(he)(he)消(xiao)化率相(xiang)關；MsGA3ox1基(ji)因(yin)(yin)下游SV使莖(jing)葉比降低22-31%，粗(cu)蛋白提(ti)(ti)升9.5%。開發的SV-GWAS方法比SNP多檢測47%的QTLs，品質(zhi)性狀(zhuang)預(yu)測準確(que)率達96.63%，基(ji)因(yin)(yin)組(zu)選(xuan)擇模型使耐鹽、發育(yu)(yu)和(he)(he)品質(zhi)性狀(zhuang)選(xuan)擇效率提(ti)(ti)升29-44%。該(gai)研(yan)(yan)究建立了多倍體泛(fan)(fan)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)研(yan)(yan)究新范式，為苜蓿分子設計育(yu)(yu)種(zhong)提(ti)(ti)供關鍵基(ji)因(yin)(yin)資源(yuan)和(he)(he)精(jing)準育(yu)(yu)種(zhong)技術。