2025-06-26
Highlights
1、WB 實(shi)驗(yan)樣本制備的(de)關鍵在于根據目標蛋白特性選擇合適(shi)裂(lie)解(jie)液（如 RIPA、NP-40 或含強去垢劑(ji)的(de)裂(lie)解(jie)液）
2、組織(zhi)和細胞樣本處(chu)理(li)需(xu)遵(zun)循速(su)凍(dong)研(yan)磨、清洗刮(gua)取等細節，蛋白定量采(cai)用 BCA 法(fa)，變性時需(xu)煮沸并(bing)離(li)心確(que)保(bao)上樣質量
3、特殊蛋白（膜蛋白、磷酸化蛋白等）制備需針對性優(you)化步驟，如使用強去垢劑、升級(ji)抑制劑或分步提取，全(quan)程(cheng)把控低溫與操作精度
還在(zai)(zai)為(wei)WB條帶上(shang)的(de)雜(za)帶、模(mo)糊或空白(bai)而抓(zhua)狂(kuang)？問題往往就出在(zai)(zai)第一(yi)步—— 樣(yang)本制備！一(yi)份高質量(liang)的(de)蛋白(bai)樣(yang)品是WB成功的(de)基石。今天就來手把手教你如何避坑，輕松搞定(ding)WB樣(yang)本制備！
一、WB裂解液的選擇及操作：你的“破壁”利器
選擇合適的(de)裂解液(ye)，是提(ti)取目標(biao)蛋(dan)白的(de)關(guan)鍵(jian)第(di)一步。常見的(de)裂解液(ye)“三(san)劍客”：
1、RIPA裂解液
組成：強效去垢劑(ji)（Triton X-100、脫氧膽酸鈉、SDS等）、鹽(yan)、緩沖液。
特點：裂解能力強，適用于大部分(fen)胞漿(jiang)蛋(dan)白(bai)、核蛋(dan)白(bai)及部分(fen)膜蛋(dan)白(bai)。
適用：總(zong)蛋白(bai)提取（尤(you)其適合溶解(jie)度較(jiao)高的蛋白(bai)）。
注意：可能破壞蛋白間互作，強(qiang)SDS可能干擾后(hou)續(xu)Bradford定量。
2、NP-40裂解液
組成：溫和非離子去垢劑NP-40、鹽、緩沖液。
特點：裂解(jie)能(neng)力溫(wen)和，能(neng)保持蛋白天然構象和相互作用。
適用：胞(bao)漿(jiang)蛋(dan)白、弱結合膜蛋(dan)白、需保持活性的蛋(dan)白（如激(ji)酶(mei)活性檢測）、免疫共沉淀(dian)（Co-IP）樣本制備。
注意：對核蛋(dan)白和跨膜(mo)蛋(dan)白提取效(xiao)率較低(di)。
3、含強去垢劑裂解液（如含SDS/尿素/硫脲）
組成：含SDS、尿素(su)、硫脲等強變(bian)性劑。
特點：裂(lie)解能力極(ji)強，能溶(rong)解難(nan)溶(rong)蛋(dan)白(bai)(bai)（如包涵體、高(gao)度疏水(shui)蛋(dan)白(bai)(bai)）。
適用：膜蛋白、核(he)基質蛋白、沉(chen)淀(dian)或(huo)聚集(ji)的(de)蛋白。
注意：強烈(lie)變(bian)性，破壞(huai)蛋白結構和相互作(zuo)用，不適用于(yu)活性分析或Co-IP。
操作關鍵：
現(xian)用現(xian)配：裂解液最好新鮮配制(zhi)，或(huo)在(zai)4℃短期保存。
冰(bing)上操作：全程低溫（冰(bing)浴）操作，抑制(zhi)蛋白酶活性。
添(tian)加(jia)抑(yi)(yi)制劑：蛋白(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制劑（如PMSF, Cocktail）和磷酸酶(mei)抑(yi)(yi)制劑（如NaF, Na3VO4, Cocktail）是(shi)必需品，根(gen)據樣本(ben)類型和目標蛋白(bai)添(tian)加(jia)。
裂(lie)解體積(ji)：根據樣本量調整，組織通常按(an)重量（mg）:體積(ji)（μl）=1:5-10；細胞(bao)按(an)數量（10?）:體積(ji)（μl）=1:50-100。
二、蛋白樣品制備關鍵點：細節決定成敗
無論組織還是細胞(bao)樣(yang)本，這些核心環節必須掌握：
1、組織樣本
取材速凍：離體后迅(xun)速(su)用液氮(dan)或干冰速(su)凍，-80℃保存。
低溫研磨：在液氮預冷的研(yan)缽中(zhong)快速研(yan)磨成(cheng)細粉，或使用組織勻(yun)漿器（全(quan)程低溫(wen)）。
快速轉移：研磨后立(li)即加入(ru)預冷的裂解液。
2、細胞樣本
徹底清洗：用預(yu)冷的PBS輕柔洗滌細(xi)胞2-3次，去除培(pei)養基雜質（尤(you)其是血清蛋(dan)白）。
輕柔刮取/消化：推薦用(yong)細(xi)胞(bao)刮刀在冰上刮取（避免胰酶消化引入酶活性和(he)(he)改變(bian)蛋白狀態）。如需胰酶消化，立即用(yong)含血清培養基中和(he)(he)并充分洗(xi)滌。
直接裂解：在培養(yang)皿/瓶中加入裂解液(ye)，冰上(shang)裂解。
3、蛋白定量
必須(xu)做！確保(bao)上樣量一致是結果可比(bi)性的基(ji)礎(chu)。
推薦BCA法：受去(qu)垢劑和還原劑影(ying)響較小，準確性(xing)高(gao)。
標曲準確：使用與待測樣品(pin)裂解液成分(fen)一致的BSA標準(zhun)品(pin)制作標準(zhun)曲(qu)線(xian)。
稀釋樣品：確保樣品吸(xi)光度(du)值落在標準曲線線性(xing)范圍內。
4、蛋白變性
加Loading Buffer：定量后，按(an)比例加入(ru)含SDS和還原劑(ji)（如β-巰基乙(yi)醇或DTT）的(de)蛋(dan)白上樣緩(huan)沖(chong)液。
煮沸：95-100℃加熱5-10分鐘(zhong)，徹底變性蛋白，打開二硫鍵。
短暫離心：煮沸后稍離(li)心，收集管壁液滴。
三、特殊蛋白樣品制備技巧：挑戰高難度
膜蛋白/跨膜蛋白：
裂解液選擇：必須使(shi)用強效裂(lie)解液（含(han)高比例去垢(gou)劑如SDS、Triton X-114，或(huo)尿素/硫脲）。
增加去垢劑濃度：在RIPA或NP-40基(ji)礎(chu)上，可額(e)外(wai)添加CHAPS、Digitonin等。
延長裂解時間/輔助手段：裂解時可配合(he)超(chao)聲破(po)碎（冰浴，短時多(duo)次），或4℃旋轉(zhuan)裂解過夜(ye)。
磷酸化蛋白：
抑制劑升級：使(shi)用(yong)強效、廣(guang)譜的(de)磷酸酶抑制劑Cocktail 。
快速處理：樣本處理速(su)度要快，避免(mian)磷(lin)酸酶去(qu)磷(lin)酸化(hua)。
低溫貫穿始終：從取材到裂(lie)解全程嚴格低溫。
避免反復凍融：分裝保(bao)存樣品(pin)，避免反復凍融導(dao)致磷酸(suan)化狀態改變。
核蛋白：
分步提取：先裂(lie)解(jie)胞漿（用(yong)較溫和裂(lie)解(jie)液如含NP-40的低滲緩沖液），離心棄上清（胞漿），再裂(lie)解(jie)沉淀的細胞核（用(yong)強效裂(lie)解(jie)液如含SDS的RIPA或(huo)高鹽緩沖液）。
核酸酶處理：裂解核(he)組(zu)分后(hou)，可(ke)加(jia)入(ru)適(shi)量核(he)酸酶（如Benzonase）降解核(he)酸，減少粘稠(chou)度。
低豐度蛋白：
增加上樣量：前提是裂(lie)解液(ye)體積允許且背景可控。
樣品濃縮：使用超(chao)濾(lv)離(li)心(xin)管、TCA/丙酮沉淀法濃縮蛋白(bai)（注意沉淀可(ke)能導致部(bu)分蛋白(bai)損失或難(nan)溶）。
減少雜質：優化裂解和離(li)心步驟，盡可(ke)能去除(chu)無關雜蛋白。
四、總結
WB樣本(ben)制(zhi)備絕非(fei)簡單的(de)(de)(de)“研磨-裂解(jie)-煮沸”，它是 精細度、標準化(hua)和耐心(xin) 的(de)(de)(de)結合。深刻(ke)理解(jie)目標蛋白的(de)(de)(de)特性，選擇(ze)匹配(pei)的(de)(de)(de)裂解(jie)液，嚴格控制(zhi)操作條(tiao)件（低溫、快速、抑制(zhi)劑），精確進行蛋白定量和變(bian)性，才能為后(hou)續的(de)(de)(de)WB實驗鋪平道(dao)路。每一次成功(gong)的(de)(de)(de)Western Blot，都(dou)始于一份(fen)完(wan)美的(de)(de)(de)樣本(ben)！派森諾竭誠為大家(jia)提供WB樣本(ben)提取過程中(zhong)所涉及的(de)(de)(de)試劑耗(hao)材(cai)，助力每一位(wei)生命科(ke)學實驗室的(de)(de)(de)科(ke)研人收獲屬于自己的(de)(de)(de)完(wan)美實驗結果，逐夢高分文章~
