2025-06-30
BSA測(ce)序相關的多組學(xue)聯合(he)分(fen)(fen)析(xi)再添高分(fen)(fen)文章啦~
近日，上海交通大學聯合國際科學家在《Plant Biotechnology Journal》發表新研究成果！首次揭示(shi)鎂螯(ao)合酶(mei)H亞基（ChlH/GUN5）通過(guo)質體逆行(xing)信號調控(kong)番茄(qie)果實成熟的全新機制。該研究不僅拓展了(le)對植物發育調控(kong)的認知，還為(wei)果蔬保鮮和品質改良提供了(le)關鍵靶點。
本研究的(de)測序和分析由上海派(pai)森諾(nuo)生物科(ke)技股份有限公(gong)司完成。
研究(jiu)背景
葉(xie)綠(lv)體(ti)作(zuo)(zuo)為環境感受器，通過逆(ni)行信號機制(zhi)(zhi)調(diao)控核基因(yin)表達。該機制(zhi)(zhi)通過四吡咯生(sheng)物(wu)合成（TPB）、質(zhi)體(ti)氧化還原狀(zhuang)態等多條(tiao)途(tu)徑傳遞(di)質(zhi)體(ti)代謝信息。利(li)用類胡蘿卜素(su)抑制(zhi)(zhi)劑(ji)Norflurazon（Nf）篩選發現(xian)，擬南(nan)芥中六(liu)個GUN基因(yin)參與TPB途(tu)徑：GUN1編(bian)碼(ma)葉(xie)綠(lv)體(ti)PPR蛋(dan)白，GUN5編(bian)碼(ma)鎂(mei)螯合酶(mei)H亞基。這些(xie)基因(yin)除調(diao)控逆(ni)行信號外(wai)，還影(ying)響(xiang)葉(xie)綠(lv)素(su)合成，但其在作(zuo)(zuo)物(wu)生(sheng)殖發育中的(de)功(gong)能尚不(bu)清楚。
番茄是研究(jiu)果(guo)(guo)實成(cheng)熟(shu)(shu)(shu)的(de)理想材(cai)料，作(zuo)為(wei)呼吸躍變(bian)型果(guo)(guo)實，成(cheng)熟(shu)(shu)(shu)伴隨(sui)乙烯(xi)合成(cheng)和呼吸增強，其中乙烯(xi)信號缺陷(xian)會顯(xian)著(zhu)延(yan)緩成(cheng)熟(shu)(shu)(shu)。成(cheng)熟(shu)(shu)(shu)過程涉及(ji)葉綠體(ti)向(xiang)有色體(ti)轉化，需要(yao)核質雙(shuang)向(xiang)通訊。研究(jiu)發現番茄質體(ti)泛(fan)素連接酶SlSP1通過調控(kong)蛋白穩(wen)態影響成(cheng)熟(shu)(shu)(shu)，暗示逆行信號可能(neng)參與成(cheng)熟(shu)(shu)(shu)調控(kong)。
通過(guo)EMS誘變(bian)(bian)獲得SlChlH錯義突變(bian)(bian)體(ti)mut26。該(gai)突變(bian)(bian)體(ti)表現出典型gun表型，且果實(shi)成(cheng)熟延遲、乙烯合成(cheng)減少、質(zhi)體(ti)轉化受阻。遺傳互補實(shi)驗證實(shi)這些表型由SlChlH突變(bian)(bian)引起，說明GUN5介(jie)導(dao)的逆行信號促進(jin)番茄(qie)果實(shi)成(cheng)熟。
研究材料與方法
1、實驗材料
EMS誘(you)變AC番茄獲得mut26突(tu)變體，mut26×LA1589構建F2分離群體，從(cong)中選取野生和突(tu)變各30株進(jin)(jin)行(xing)混池(chi)構建，與親本“mut26”和LA1589進(jin)(jin)行(xing)測序。
2、實驗材料
Illumina
3、分析(xi)內容
Mutmap、RNAseq、蛋白(bai)質分析、生(sheng)理指標測定、顯微觀察等技術多維度驗證(zheng)基因功(gong)能。
研究(jiu)結果
BSA：葉綠素缺陷型番(fan)茄(qie)突變(bian)體的分離與(yu)定位
通過EMS誘(you)變獲得的番茄(qie)突變體(ti)mut26（Ailsa Craig背景）表現出葉(xie)片黃化表型（圖(tu)(tu)1a）,且(qie)其(qi)葉(xie)綠(lv)體(ti)發育明顯(xian)受阻(zu)（圖(tu)(tu)1b、1c、1d）。選(xuan)擇mut26×LA1589的F2群體(ti)進(jin)行(xing)BSA定位(wei)(wei)，定位(wei)(wei)到chr.4上的三個區(qu)域(yu)(yu)（超過99%置信閾(yu)值）：4.9-8.6 Mb、9.1-51.5 Mb和52-56 Mb（圖(tu)(tu)1e）。對野生型AC測序分析，候選(xuan)區(qu)域(yu)(yu)內僅SL2.50ch04_6038590位(wei)(wei)點位(wei)(wei)于(yu)編(bian)碼區(qu)。該SNP位(wei)(wei)于(yu)SlChlH基因(yin)（Solyc04g015750），導(dao)致(zhi)Pro398→Ser錯義突變（圖(tu)(tu)1f）。利(li)用(yong)AC×mut26和mut26×LA1589兩個F2群體(ti)進(jin)行(xing)CAPS驗證，證實SlChlH突變是導(dao)致(zhi)mut26表型的原因(yin)。
圖(tu)1 葉綠素缺(que)陷(xian)型番茄突(tu)變體mut26的遺傳定位
mut26是一個gun突變體(ti)
施加類胡蘿卜素抑制劑Nf后，mut26中多(duo)個SlPhANG表(biao)(biao)達受(shou)抑制程度較輕，表(biao)(biao)明其具有GUN表(biao)(biao)型(xing)（圖 2a）。根據擬南芥的命名規則(ze)，mut26是番茄中的gun5突變體，且SlPhANGs的表(biao)(biao)達模式表(biao)(biao)明它是一個弱GUN突變體。
利用CRISPR-Cas9技術獲得了兩個純合突變株系(xi)——一個在SlChlH第(di)一外(wai)顯(xian)子存在2-bp 缺失，另一個存在1-bp 插(cha)入。這兩株突變體均表(biao)現出強(qiang)烈的白化苗表(biao)型（圖 2b）。
出乎意料的是，mut26中SlChlH 蛋白的水(shui)平較WT顯著升高，而(er)其轉錄水(shui)平仍與 WT 相(xiang)當（圖 2c,d）。綜(zong)上，這些結果表(biao)明，SlChlH突(tu)變是導致(zhi)mut26兼具GUN 表(biao)型和(he)葉綠素(su)缺(que)陷表(biao)型的原因。
圖2 mut26是(shi)一種番(fan)茄(qie)gun突變(bian)體(ti)
四吡(bi)咯合成在 mut26 突(tu)變體中減弱
通過HPLC檢測了mut26中(zhong)四吡咯中(zhong)間(jian)產物的(de)(de)含(han)量。結果顯(xian)示：mut26葉(xie)片中(zhong)的(de)(de)總(zong)葉(xie)綠(lv)(lv)素(su)含(han)量僅為(wei)(wei)野生型的(de)(de)約43%（圖3a），而5-氨基乙酰丙酸（ALA）的(de)(de)合成(cheng)速(su)率約為(wei)(wei)野生型的(de)(de)47%（圖3b），這可能是(shi)由于葉(xie)綠(lv)(lv)素(su)含(han)量降低引起(qi)的(de)(de)反饋調節所致。
與野(ye)生型(xing)和互(hu)補株(zhu)系相比，mut26中所(suo)(suo)有(you)(you)四(si)吡(bi)咯中間產物的(de)(de)(de)穩態水平均(jun)有(you)(you)所(suo)(suo)降低(di)（圖(tu)3c）。雖然預期會(hui)因催化底(di)物轉(zhuan)化受阻而(er)導致原卟(bu)啉IX積(ji)累，但mut26中的(de)(de)(de)Proto IX含(han)量(liang)與野(ye)生型(xing)相當（圖(tu)3d）。這一結(jie)果與煙草(cao)研究結(jie)果一致。相比之下(xia)，mut26中非共價結(jie)合血紅素的(de)(de)(de)積(ji)累速率沒有(you)(you)明(ming)顯變化（圖(tu)3e）。目前尚不(bu)清(qing)楚(chu)SlChlH突變如(ru)何影響(xiang)TPB途徑中其他蛋白的(de)(de)(de)積(ji)累。
圖3 mut26突變體中(zhong)四吡咯合成減(jian)少
mut26果實成熟過程(cheng)出現(xian)延遲
SlChlH轉錄水平在花(hua)后35天（dpa）開始上升，41 dpa達到峰值后下降（圖(tu)(tu)4a）。在此期(qi)(qi)間，SlChlH蛋白水平與轉錄水平變化趨勢一(yi)致（圖(tu)(tu)4b）。這一(yi)表達模式促使我們(men)探究SlChlH是否直接調控果(guo)實成熟。破色期(qi)(qi)（BR）起始被(bei)視為番茄果(guo)實成熟的(de)標(biao)志。mut26果(guo)實發育至MG期(qi)(qi)與WT基本(ben)一(yi)致，但(dan)后續成熟過程較WT延(yan)遲約3天（圖(tu)(tu)4c）。
果(guo)實(shi)(shi)乙烯釋放表明mut26僅在同(tong)期呈現中(zhong)度(du)增加(jia)，峰值(zhi)延遲至(zhi)41 dpa，互補株系#6的乙烯釋放早于WT（圖4d），與(yu)其早熟表型(xing)一致，表明SlChlH并非果(guo)實(shi)(shi)成熟的必(bi)需因子。
UPLC分析顯(xian)示(shi)，44 dpa時mut26的β-胡蘿卜素和(he)番(fan)茄紅素含量(liang)顯(xian)著(zhu)低于WT，互補株(zhu)系#6中恢復至WT水平（圖4e）。TEM觀察發現：mut26的葉綠(lv)體發育(yu)較WT遲緩。質體小球（PGs）數量(liang)在mut26中顯(xian)著(zhu)減少（圖4g）。
圖4 mut26突變體(ti)表(biao)現出乙烯釋放量降(jiang)低(di)和果(guo)實成熟延遲的表(biao)型
質(zhi)體逆行信號與成(cheng)熟相關基因表(biao)達在mut26中受損
比(bi)較35 dpa（MG期）和(he)(he)38 dpa的轉錄組，發現WT中(zhong)鑒(jian)定(ding)到(dao)4012個(ge)差異表(biao)達(da)基(ji)(ji)因（DEGs，1388上調/2624下調），而(er)(er)mut26僅1897個(ge)（882上調/1015下調）（圖(tu)5a）。19個(ge)推定(ding)SlPhANGs中(zhong)，17個(ge)被RNA-seq檢測到(dao)（圖(tu)5b）。除SlCBP2和(he)(he)SlRBCS3B在(zai)(zai)兩者中(zhong)均(jun)被抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)外(wai)，其余15個(ge)SlPhANGs在(zai)(zai)WT中(zhong)被抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)而(er)(er)在(zai)(zai)mut26中(zhong)僅部分抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)。RT-qPCR證實(shi)SlCAB1B、SlCAB1C和(he)(he)SlRBCS1在(zai)(zai)WT中(zhong)35-38 dpa被顯著抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)，而(er)(er)mut26抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)程度較輕(qing)（圖(tu)5c）。乙烯合成通(tong)(tong)路和(he)(he)信號(hao)通(tong)(tong)路關鍵基(ji)(ji)因在(zai)(zai)WT成熟期被誘導(dao)，而(er)(er)mut26中(zhong)誘導(dao)受損（圖(tu)5d）。類胡蘿卜素合成和(he)(he)細胞壁降解相關基(ji)(ji)因的誘導(dao)表(biao)達(da)在(zai)(zai)mut26中(zhong)同樣受阻（圖(tu)5d）。
關(guan)鍵轉錄因(yin)(yin)子分析顯示：TAGL1、FUL1和AP2a以GUN5依賴方式被誘導（圖(tu)5d），這些結果(guo)表明SlChlH(GUN5)通過調控RIN等轉錄因(yin)(yin)子及乙烯合成、類胡蘿卜素積累(lei)和細(xi)胞壁降解相關(guan)基(ji)因(yin)(yin)來促進果(guo)實(shi)成熟。
圖5 果(guo)實成(cheng)熟期間mut26突變體內多個(ge)成(cheng)熟相關基(ji)因(yin)及逆行信號(hao)靶基(ji)因(yin)的異(yi)常表達
SlHY5在(zai)GUN5下游調控質體逆行信號傳導
已有研(yan)究(jiu)表明，擬南芥中HY5蛋白(bai)參與GUN5介導(dao)(dao)的(de)逆行信(xin)號(hao)通(tong)(tong)路，通(tong)(tong)過(guo)構建mut26 Slhy5雙突，分析SlHY5對GUN5介導(dao)(dao)的(de)質體逆行信(xin)號(hao)通(tong)(tong)路的(de)影響。
室(shi)溫培養時，雙突(tu)與Slhy5單突(tu)一樣，在幼苗早期(qi)表(biao)現出下胚(pei)軸伸(shen)長但(dan)無白化(hua)表(biao)型，但(dan)生長后期(qi)，無論(lun)在室(shi)內常(chang)溫還是室(shi)外低溫，mut26 Slhy5都表(biao)現出嚴重白化(hua)表(biao)型（圖6a）。
檢測Nf處理的5日齡幼苗(miao)(miao)中(zhong)SlPhANGs的表(biao)達顯示(shi)：Slhy5單突未表(biao)現(xian)明顯gun表(biao)型；mut26的gun表(biao)型在(zai)雙突中(zhong)被抑制(zhi)（圖6b-d）。這(zhe)些數據(ju)表(biao)明，在(zai)幼苗(miao)(miao)期SlHY5位于GUN5介導的質體逆行(xing)信號通路(lu)下游，對SlPhANGs表(biao)達起促進作用，該作用受(shou)GUN5抑制(zhi)。
圖6質體逆(ni)行信號通路中SlHY5作用(yong)于GUN5下游，促(cu)進SlPhANGs基因的表(biao)達
Slhy5單突變體中逆行信(xin)號未受(shou)影響(xiang)
先前(qian)研究發現(xian)Slhy5敲(qiao)除突變體(ti)表現(xian)果實(shi)著色延遲的(de)異(yi)(yi)常成熟表型。本(ben)文通過直(zhi)接標記MG、BR、BR+3和(he)BR+6等成熟階(jie)段(duan)的(de)果實(shi)發現(xian)：Slhy5從(cong)MG到BR+6階(jie)段(duan)的(de)果實(shi)著色速率較WT減(jian)慢（圖(tu)7a）；BR+6階(jie)段(duan)β-胡蘿卜(bu)素和(he)番茄(qie)紅素含量(liang)低于WT（圖(tu)7b）。但(dan)Slhy5在(zai)MG和(he)BR階(jie)段(duan)的(de)乙烯釋放量(liang)與WT相當（圖(tu)7c），成熟相關基因（ACS2、ACO1、PSY1、RIN、TAGL1和(he)FUL1）表達(da)與WT無差異(yi)(yi)（圖(tu)7d）。因此(ci)得出結(jie)論：除影響果實(shi)著色外，SlHY5不調控乙烯合成或成熟進(jin)程。
圖7除了在(zai)MG到BR階段加速果實色素(su)沉(chen)著(zhu)外，SlHY5對(dui)果實成熟進程沒有其他影響
結 論
研(yan)究團隊(dui)通過化學誘變技術，意外獲得了(le)一種"慢性子"番茄(qie)突變體(ti)mut26。這種番茄(qie)的成熟速(su)度比普通品種慢了(le)整(zheng)整(zheng)3天，乙烯釋放量減(jian)少，果肉更緊實，類胡(hu)蘿卜素積累延遲——簡單(dan)來說，它就像被按下了(le)"減(jian)速(su)鍵(jian)"，意義重大：
1、破(po)解"成熟(shu)(shu)密碼"：過去認為乙烯是果實(shi)成熟(shu)(shu)的唯一(yi)開關(guan)，但研究(jiu)發現，葉綠體發出的信號同(tong)樣至關(guan)重要。SlChlH如同(tong)一(yi)個"指揮官"，協調葉綠體退(tui)化與(yu)核基因表達(da)，確保(bao)成熟(shu)(shu)過程精準(zhun)有序。
2、抗衰老番(fan)茄(qie)的潛力：通過調(diao)控SlChlH，未來(lai)可(ke)培(pei)育(yu)耐儲存(cun)、慢成(cheng)熟的番(fan)茄(qie)品種，減(jian)少(shao)運輸損耗，甚至讓番(fan)茄(qie)在貨架上(shang)多保鮮(xian)數天！
3、農業應用前景廣闊：該(gai)機(ji)制可能適(shi)用于其他茄科作物（如(ru)辣椒、茄子），為農產品(pin)保鮮和(he)品(pin)質(zhi)改(gai)良(liang)提供新(xin)思路。
文章索(suo)引：Dawei Xu.,Li Lin.,Xiaorui Liu., et al.Characterization of a tomato chlh mis-sense mutant reveals a new function of ChlH in fruit ripening.Plant Biotechnol J.2025 Mar;23(3):911-926.doi: 10.1111/pbi.14548.Epub 2024 Dec 19
