文(wen)章(zhang)信(xin)息

英文題(ti)目：Combined GWAS and eGWAS reveals the genetic basis underlying drought tolerance in emmer wheat(Triticum turgidum L.)

中文題目：結合全基因(yin)組(zu)關聯分析(xi)和(he)表達數量性(xing)狀位點分析(xi)揭示二(er)粒小麥(mai)(Triticum turgidum L.)耐(nai)旱(han)性(xing)的遺傳基礎

發(fa)表期刊：New Phytologist

影響因(yin)子：8.1/Q1

發(fa)表時間：2024.01.25

涉及組學：GWAS、轉(zhuan)錄(lu)組測序、eGWAS。

摘要

• 干(gan)旱(han)是全球小(xiao)麥(mai)(mai)生產(chan)面臨的(de)主要環(huan)境制(zhi)約因(yin)素之一。作為(wei)普(pu)通小(xiao)麥(mai)(mai)的(de)祖先(xian)和基因(yin)庫(ku)，二(er)粒小(xiao)麥(mai)(mai)被視為(wei)培育耐(nai)旱(han)小(xiao)麥(mai)(mai)的(de)寶貴基因(yin)資源庫(ku)。

• 通過對(dui)107份種質(zhi)材料進行GWAS和eGWAS聯合分析，我(wo)們(men)鑒定出(chu)86個(ge)數量性狀位點(QTL)、105462個(ge)表(biao)達數量性狀位點(eQTL)以及68個(ge)與二(er)粒小麥耐旱性(DT)相(xiang)關的(de)eQTL熱點區(qu)域。

• 研(yan)究(jiu)構(gou)建了一個(ge)由185個(ge)上游調控(kong)因子和2432個(ge)下(xia)游干旱(han)響應候選基因組成的復雜調控(kong)網絡，其中發現(xian)TtOTS1基因通過影(ying)響根系發育對耐(nai)旱(han)性產(chan)生負調控(kong)作用。

• 本(ben)研究揭(jie)示了(le)耐旱性(xing)的遺(yi)傳(chuan)基(ji)礎(chu)，將為優良耐旱小(xiao)麥品(pin)種的改良育種提(ti)供不可或缺的基(ji)因(yin)資(zi)源(yuan)和種質材(cai)料。

前言

小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)（Triticum aestivum L.）是(shi)(shi)全球(qiu)(qiu)最(zui)重要的(de)(de)主糧作物(wu)之一，其(qi)年(nian)產(chan)量超(chao)過6億噸，為(wei)人(ren)(ren)類提供了約20%的(de)(de)熱(re)量攝入。干(gan)旱(han)脅迫被認為(wei)是(shi)(shi)限制小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)生(sheng)產(chan)最(zui)具破壞性(xing)的(de)(de)環境(jing)因(yin)素。據報道(dao)，1980年(nian)代(dai)至2010年(nian)代(dai)期間，干(gan)旱(han)導致的(de)(de)小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)減產(chan)幅度高達21%，嚴(yan)重威脅全球(qiu)(qiu)糧食安全。為(wei)應(ying)對人(ren)(ren)口增(zeng)長(chang)與氣(qi)候惡化的(de)(de)雙重挑戰，急需培育高產(chan)耐旱(han)的(de)(de)小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)品(pin)種。盡管(guan)已有(you)大量研究揭示了調控(kong)(kong)小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)干(gan)旱(han)響應(ying)與耐受(shou)性(xing)的(de)(de)數量性(xing)狀位點(dian)（QTLs）、候選基(ji)(ji)因(yin)及(ji)分子模塊，但優異(yi)基(ji)(ji)因(yin)資(zi)源匱乏和(he)(he)遺傳多樣性(xing)狹窄仍(reng)是(shi)(shi)小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)改良面(mian)臨的(de)(de)突出問題。四倍體二(er)(er)粒小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)（Triticum turgidum L.）作為(wei)現代(dai)面(mian)包小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)A、B亞(ya)基(ji)(ji)因(yin)組的(de)(de)祖先種，貢獻了小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)三分之二(er)(er)的(de)(de)遺傳物(wu)質，其(qi)基(ji)(ji)因(yin)庫包含野生(sheng)型、地方品(pin)種和(he)(he)現代(dai)栽培品(pin)種。二(er)(er)粒小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)豐富的(de)(de)遺傳多樣性(xing)為(wei)提升小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)產(chan)量和(he)(he)環境(jing)適應(ying)性(xing)提供了不可或(huo)缺的(de)(de)遺傳資(zi)源。因(yin)此，挖(wa)掘二(er)(er)粒小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)中控(kong)(kong)制耐旱(han)性(xing)的(de)(de)關鍵物(wu)種特(te)異(yi)性(xing)基(ji)(ji)因(yin)，有(you)望通過直(zhi)接雜交或(huo)基(ji)(ji)因(yin)工程手段(duan)培育超(chao)級耐旱(han)小(xiao)(xiao)麥(mai)(mai)(mai)。

GWAS與表達(da)數(shu)(shu)量性狀位點(dian)（eQTL）分析的(de)結合為(wei)解(jie)析復雜農(nong)藝性狀的(de)遺(yi)傳基(ji)(ji)礎(chu)提供了高效手段，已在(zai)甘(gan)藍型油(you)菜籽粒含油(you)量、棉花次(ci)生細胞壁(bi)發育和玉米耐(nai)旱性等領域得到應用，但小(xiao)麥特別是二粒小(xiao)麥的(de)相關研究(jiu)仍十分匱乏。本(ben)研究(jiu)通過(guo)對107份代表性材料(liao)的(de)全基(ji)(ji)因組重測序數(shu)(shu)據開(kai)展GWAS和eGWAS分析，結合生物量與三個根系相關性狀的(de)關聯研究(jiu)，挖掘二粒小(xiao)麥耐(nai)旱性的(de)因果基(ji)(ji)因并解(jie)析其遺(yi)傳機制。所獲eQTLs/QTLs及新(xin)候選(xuan)基(ji)(ji)因不(bu)僅(jin)將豐富小(xiao)麥遺(yi)傳資源以加速培育超耐(nai)旱品種，也為(wei)解(jie)析耐(nai)旱性遺(yi)傳基(ji)(ji)礎(chu)開(kai)辟了新(xin)途(tu)徑。

研(yan)究內容

1.二粒小麥群體的耐旱性

為評估干旱脅(xie)迫下(xia)的(de)表(biao)現(xian)，我們(men)對107份二粒小(xiao)(xiao)麥種質(zhi)資源進行了(le)苗期持續(xu)干旱脅(xie)迫處理(li)（圖1a）。在(zai)充分供水（WW）和(he)水分脅(xie)迫（WS）條(tiao)件下(xia)測定了(le)各材(cai)料的(de)生(sheng)物量(liang)（BM）和(he)根系(xi)性(xing)狀。所有性(xing)狀在(zai)WS條(tiao)件下(xia)均顯著低于WW條(tiao)件（圖1b,c），其中生(sheng)物量(liang)在(zai)兩(liang)種水分條(tiao)件下(xia)的(de)變異(yi)系(xi)數(shu)（CV）達33%-38%，較根系(xi)性(xing)狀呈現(xian)更大(da)波動(dong)。值(zhi)得注意的(de)是，野生(sheng)二粒小(xiao)(xiao)麥（WEW，圓錐(zhui)(zhui)小(xiao)(xiao)麥野生(sheng)亞(ya)種）和(he)栽培二粒小(xiao)(xiao)麥（DEW，圓錐(zhui)(zhui)小(xiao)(xiao)麥栽培亞(ya)種）的(de)四個性(xing)狀CV值(zhi)均因干旱誘導而上升，但硬(ying)(ying)粒小(xiao)(xiao)麥（DW，圓錐(zhui)(zhui)小(xiao)(xiao)麥硬(ying)(ying)粒亞(ya)種）的(de)CV值(zhi)卻呈現(xian)下(xia)降趨勢（圖1d），表(biao)明DW在(zai)脅(xie)迫條(tiao)件下(xia)表(biao)現(xian)出較低的(de)多樣性(xing)。

圖1.在充分灌(guan)溉（WW）和水分脅迫（WS）條件下的二粒小麥表(biao)型表(biao)現

2.107份(fen)二粒小麥(mai)種質的群體轉錄組分析

研究人(ren)員進一步對107份種質材料在正(zheng)常供水(shui)(WW)和(he)干(gan)旱脅迫(WS)條件下的根(gen)組織(zhi)進行了RNA-Seq分析(xi)(xi)。主成(cheng)分分析(xi)(xi)圖將所有樣(yang)本完全劃(hua)分為WW和(he)WS兩組，表明干(gan)旱脅迫引發(fa)了顯著的轉錄組差異(yi)(yi)(圖2a)。研究發(fa)現(xian)根(gen)長(chang)(RL)與PC1和(he)PC3呈(cheng)(cheng)負相(xiang)關，與PC2呈(cheng)(cheng)正(zheng)相(xiang)關(圖2b)，說明根(gen)長(chang)對表達變異(yi)(yi)有重要貢獻。此外，PC2與生物量(BM)和(he)根(gen)表面積(RA)呈(cheng)(cheng)正(zheng)相(xiang)關，PC3則分別與BM、RA和(he)根(gen)體積(RV)呈(cheng)(cheng)負相(xiang)關。

進一步鑒(jian)定出(chu)9,301個(ge)干(gan)旱響(xiang)應基(ji)(ji)因(圖2c)，根據(ju)其在干(gan)旱脅(xie)迫(po)(po)下的表達模式可(ke)分為三個(ge)簇(cu)。其中11.1%的基(ji)(ji)因(簇(cu)I)在干(gan)旱脅(xie)迫(po)(po)下表達下調(圖2d)，這些基(ji)(ji)因富集于氧化還原酶活性(xing)、蛋白(bai)絲氨(an)酸/蘇氨(an)酸激酶活性(xing)、煙(yan)酰胺合成酶活性(xing)等蛋白(bai)功能條目(mu)(圖2e)。研究(jiu)還鑒(jian)定出(chu)多(duo)個(ge)已知抗旱基(ji)(ji)因(圖2d)，包括(kuo)Ras相關蛋白(bai)(TtRAB18)、小生長(chang)素(su)上調基(ji)(ji)因(TtSAUR1)、脫水素(su)基(ji)(ji)因(TtXERO1、TtXERO2)、胚(pei)胎(tai)發(fa)育晚期豐(feng)富蛋白(bai)基(ji)(ji)因(TtLEA7、TtLEA14、TtLEA29、TtLEA46)以(yi)及(ji)生長(chang)素(su)相關基(ji)(ji)因(TtJAR1和(he)TtNPH4)。

圖2.野生(sheng)二粒小麥響應干旱脅迫(po)的轉錄(lu)組動態變化

3.干旱響(xiang)應基因表達(da)的選擇壓力

為(wei)研究(jiu)干(gan)旱響應基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)表(biao)(biao)達(da)的(de)(de)自然選擇(ze)(ze)(ze)機制，根據(ju)干(gan)旱脅迫下(xia)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)表(biao)(biao)達(da)豐(feng)度(du)與(yu)(yu)表(biao)(biao)型(xing)性(xing)(xing)狀(zhuang)的(de)(de)關系(xi)(xi)，計算了(le)單(dan)變量線性(xing)(xing)選擇(ze)(ze)(ze)差（S）值(zhi)。干(gan)旱響應基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)在BM、RL、RA和RV性(xing)(xing)狀(zhuang)中(zhong)(zhong)的(de)(de)平(ping)(ping)均(jun)選擇(ze)(ze)(ze)強度(du)(|S|)分(fen)別為(wei)0.065、0.097、0.070和0.057(圖(tu)3a)，表(biao)(biao)明大多(duo)數基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)表(biao)(biao)達(da)的(de)(de)變異近乎中(zhong)(zhong)性(xing)(xing)。共有(you)4293個(ge)獨特差異表(biao)(biao)達(da)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(DEGs)明顯受(shou)(shou)到四個(ge)性(xing)(xing)狀(zhuang)的(de)(de)選擇(ze)(ze)(ze)作用(yong)(圖(tu)3b)。其中(zhong)(zhong)正向選擇(ze)(ze)(ze)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)數量占(zhan)比超(chao)過50%，表(biao)(biao)現為(wei)更高的(de)(de)BM值(zhi)和更強根系(xi)(xi)伴隨更高基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)表(biao)(biao)達(da)水平(ping)(ping)。有(you)939個(ge)DEGs同時受(shou)(shou)到四個(ge)性(xing)(xing)狀(zhuang)的(de)(de)選擇(ze)(ze)(ze)，包(bao)括(kuo)一些既與(yu)(yu)耐旱性(xing)(xing)又與(yu)(yu)根系(xi)(xi)發育相(xiang)關的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(圖(tu)3c)。例如(ru)根系(xi)(xi)發育相(xiang)關基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)TtMOR1(擬南芥(jie)AtMOR1的(de)(de)同源基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin))在四個(ge)性(xing)(xing)狀(zhuang)中(zhong)(zhong)均(jun)受(shou)(shou)到正向選擇(ze)(ze)(ze)，平(ping)(ping)均(jun)S值(zhi)為(wei)0.14(圖(tu)3d)。已被報道與(yu)(yu)耐旱性(xing)(xing)相(xiang)關的(de)(de)AtABA4，在本研究(jiu)結果中(zhong)(zhong)也(ye)顯示其同源基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)TtABA4(擬南芥(jie)AtABA4的(de)(de)同源基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin))是顯著負向選擇(ze)(ze)(ze)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)。有(you)趣的(de)(de)是，研究(jiu)人(ren)員(yuan)還觀察到這些選擇(ze)(ze)(ze)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)及部分(fen)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)家族在三個(ge)干(gan)旱脅迫下(xia)的(de)(de)亞群(qun)體表(biao)(biao)明人(ren)工選擇(ze)(ze)(ze)也(ye)影響了(le)干(gan)旱響應基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)。

圖3.二粒小麥干旱響應基因的選擇強度和選擇模式(shi)

4.二粒小麥耐旱性的eGWAS研究

基(ji)(ji)(ji)(ji)于(yu)全基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)關(guan)(guan)聯分(fen)(fen)析(xi)（GWAS）采用的(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)同基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)變(bian)異數(shu)據(ju)集(ji)，本研究(jiu)進一步(bu)開展了(le)表(biao)達數(shu)量性(xing)狀位點(dian)(dian)分(fen)(fen)析(xi)（eGWAS），以鑒(jian)(jian)定(ding)與基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)表(biao)達水(shui)平相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)遺(yi)傳位點(dian)(dian)。通(tong)過(guo)(guo)(guo)分(fen)(fen)析(xi)，共發(fa)現105,462個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)與24,605個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)eGenes（受(shou)eQTL調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)）表(biao)達相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)eQTLs，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)79.7%的(de)(de)(de)(de)(de)靶向(xiang)關(guan)(guan)系通(tong)過(guo)(guo)(guo)HiC數(shu)據(ju)得到驗證，證實了(le)所識(shi)別eQTLs的(de)(de)(de)(de)(de)準確性(xing)。靜態(tai)(tai)eQTLs代表(biao)在(zai)(zai)(zai)水(shui)分(fen)(fen)充足（WW）和水(shui)分(fen)(fen)脅迫（WS）條件(jian)下(xia)(xia)均(jun)被穩定(ding)檢測到的(de)(de)(de)(de)(de)eGene，而僅在(zai)(zai)(zai)單一條件(jian)下(xia)(xia)檢測到的(de)(de)(de)(de)(de)eQTLs被歸(gui)類為(wei)動(dong)態(tai)(tai)eQTLs。本研究(jiu)共鑒(jian)(jian)定(ding)出(chu)88,664個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)靜態(tai)(tai)eQTLs和16,798個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)動(dong)態(tai)(tai)eQTLs（圖4a）。結果發(fa)現，7.4%的(de)(de)(de)(de)(de)eQTL-eGene對(dui)位于(yu)同一染色(se)(se)體(ti)上(圖4b)。此外，研究(jiu)進一步(bu)鑒(jian)(jian)定(ding)出(chu)68個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)eQTL熱(re)(re)(re)點(dian)(dian)區域（包含(han)2366個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)eQTL位點(dian)(dian)）（圖4c），這(zhe)些熱(re)(re)(re)點(dian)(dian)調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)著8253個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達。每個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)熱(re)(re)(re)點(dian)(dian)區域調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)的(de)(de)(de)(de)(de)eGene數(shu)量從(cong)177個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)（Hotspot59）到1674個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)（Hotspot45）不等(deng)。這(zhe)些受(shou)eQTL熱(re)(re)(re)點(dian)(dian)調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)的(de)(de)(de)(de)(de)eGene顯(xian)著富集(ji)于(yu)干旱(han)脅迫和根(gen)(gen)系發(fa)育(yu)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)通(tong)路。例(li)如：1B染色(se)(se)體(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)Hotspot4調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)過(guo)(guo)(guo)氧(yang)化物(wu)酶(mei)及(ji)氧(yang)化應激響應基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)；5A染色(se)(se)體(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)Hotspot34調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)側(ce)根(gen)(gen)形(xing)成相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)；5B染色(se)(se)體(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)Hotspot42調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)過(guo)(guo)(guo)氧(yang)化氫分(fen)(fen)解代謝(xie)過(guo)(guo)(guo)程及(ji)缺水(shui)響應相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)（圖4c）。基(ji)(ji)(ji)(ji)于(yu)這(zhe)些eQTL和eGene數(shu)據(ju)，本研究(jiu)構建了(le)每個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)eQTL熱(re)(re)(re)點(dian)(dian)的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)網絡(luo)。其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)Hotspot38網絡(luo)包含(han)46個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)靜態(tai)(tai)eQTL和15個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)動(dong)態(tai)(tai)eQTL，調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)1083個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)下(xia)(xia)游基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，包括生長素相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)（TtPIN8、TtIAA8）和轉(zhuan)運蛋白基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)（TtYSL6、TtABCG17）（圖4d）；Hotspot51網絡(luo)包含(han)121個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)靜態(tai)(tai)eQTL和89個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)動(dong)態(tai)(tai)eQTL，調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)1366個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)下(xia)(xia)游基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)包括多個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)（TtbZIP9、TtMYB50、TtWRKY70等(deng)）（圖4e）。值得注(zhu)意(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)是，530個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)位于(yu)64個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)（94.1%）eQTL熱(re)(re)(re)點(dian)(dian)區域內，其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)30個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)編碼轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)或轉(zhuan)錄(lu)調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)分(fen)(fen)布在(zai)(zai)(zai)21個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)eQTL熱(re)(re)(re)點(dian)(dian)中(zhong)(zhong)，如TtNAC2、TtMYB14、TtELF6。此外，研究(jiu)發(fa)現4個(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)(ge)eQTL熱(re)(re)(re)點(dian)(dian)完全位于(yu)基(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)組(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)非編碼區，提(ti)示eQTL中(zhong)(zhong)可能還存在(zai)(zai)(zai)調(diao)(diao)(diao)(diao)控(kong)(kong)下(xia)(xia)游eGene的(de)(de)(de)(de)(de)非編碼RNA。

圖(tu)4.在二粒(li)小麥中(zhong)鑒(jian)定(ding)良(liang)好灌溉（WW）和水分脅迫（WS）條件下的表(biao)達數量(liang)性狀(zhuang)位點（eQTL）

5.整合數量性狀位點(dian)與表達(da)數量性狀位點(dian)揭示抗(kang)旱性因(yin)果(guo)基因(yin)

為進(jin)一步揭示二粒小麥(mai)耐(nai)旱(han)(han)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)遺傳基礎，本研究整合了(le)全(quan)基因(yin)(yin)(yin)組關(guan)(guan)聯分析(xi)（GWAS）和(he)表(biao)達(da)數(shu)量性(xing)(xing)(xing)狀位(wei)點分析(xi)（eGWAS）結(jie)果。共(gong)(gong)定(ding)位(wei)到86個數(shu)量性(xing)(xing)(xing)狀位(wei)點（QTL），包(bao)含190個eQTL和(he)989個GWAS信號（圖5a,b）。部分變異(yi)位(wei)點同時與(yu)表(biao)型性(xing)(xing)(xing)狀和(he)基因(yin)(yin)(yin)表(biao)達(da)相關(guan)(guan)。通(tong)過(guo)二粒小麥(mai)與(yu)玉米eQTL的(de)(de)共(gong)(gong)線性(xing)(xing)(xing)分析(xi)（Liu et al., 2020），本研究鑒定(ding)出18個（9.5%）保守的(de)(de)耐(nai)旱(han)(han)相關(guan)(guan)eQTL，包(bao)含TtCDPK、TtUGT85A2、TtSWEETIE等36個上游(you)基因(yin)(yin)(yin)（圖5c）。基于(yu)(yu)(yu)共(gong)(gong)定(ding)位(wei)的(de)(de)eQTL與(yu)QTL，我們(men)進(jin)一步構(gou)建了(le)二粒小麥(mai)耐(nai)旱(han)(han)性(xing)(xing)(xing)調控網(wang)絡。與(yu)既往(wang)研究一致（Deng et al., 2022），eGenes和(he)區間重疊基因(yin)(yin)(yin)可分為三級：上游(you)層(ceng)（174個基因(yin)(yin)(yin)）、下游(you)層(ceng)（5919個基因(yin)(yin)(yin)）和(he)中間層(ceng)（11個基因(yin)(yin)(yin)），其中包(bao)含2432個干旱(han)(han)響(xiang)應下游(you)基因(yin)(yin)(yin)。上游(you)基因(yin)(yin)(yin)的(de)(de)表(biao)達(da)水平顯著高(gao)于(yu)(yu)(yu)下游(you)基因(yin)(yin)(yin)，且其表(biao)達(da)變異(yi)性(xing)(xing)(xing)低于(yu)(yu)(yu)中、下游(you)基因(yin)(yin)(yin)。

圖5.二粒(li)小(xiao)麥GWAS與eQTL的(de)整合分析

6.TtOTS1是干旱耐受(shou)性的負調(diao)控因子(zi)

基(ji)于(yu)(yu)(yu)上(shang)述分(fen)析，在TRIDC5AG008150.2（反向鏈）的(de)eQTL chr5A:49280938_49316775（P值=6.31×10^-22）區域(yu)內(nei)發現一個插(cha)入缺失(shi)變異(yi)（chr5A:49296105，GAGTT>G），該(gai)變異(yi)與DTIs顯著相關（P值=1.96×10^-7）（圖6a）。因(yin)此(ci)，研究人員(yuan)將其(qi)(qi)(qi)命名為TtOTS1。具(ju)有插(cha)入基(ji)因(yin)型(xing)的(de)材料(liao)（樣本(ben)數(shu)：85）在其(qi)(qi)(qi)CDS序(xu)列的(de)第2323 bp處(chu)存在AACT序(xu)列。TtOTS1基(ji)因(yin)。相反，缺失(shi)基(ji)因(yin)型(xing)（del-AACT）樣本(ben)（樣本(ben)數(shu)：6）丟(diu)失(shi)了這四個堿(jian)基(ji)。該(gai)InDel變異(yi)位于(yu)(yu)(yu)終止密(mi)碼(ma)(ma)子下游13個堿(jian)基(ji)處(chu)，導(dao)致移(yi)碼(ma)(ma)突(tu)變，所有材料(liao)可分(fen)為ins-AACT單(dan)倍(bei)型(xing)和del-AACT單(dan)倍(bei)型(xing)（圖6b）。del-AACT單(dan)倍(bei)型(xing)的(de)DTI值顯著大(da)于(yu)(yu)(yu)ins-AACT單(dan)倍(bei)型(xing)（圖6c），而其(qi)(qi)(qi)表達水平卻低于(yu)(yu)(yu)ins-AACT單(dan)倍(bei)型(xing)（圖6d,e），表明其(qi)(qi)(qi)可能(neng)作為負調控因(yin)子發揮(hui)作用。

本研究通過一(yi)代測序(xu)(xu)進一(yi)步驗(yan)證(zheng)該InDel變異，發現(xian)TtOTS1基(ji)(ji)因的del-AACT變異導(dao)致其(qi)丟失RRACH基(ji)(ji)序(xu)(xu)（R = A/G，H = A/C/U）（圖(tu)6a），該基(ji)(ji)序(xu)(xu)是與m6A甲基(ji)(ji)化(hua)修(xiu)飾(shi)相關的特(te)異性(xing)保(bao)守(shou)基(ji)(ji)序(xu)(xu)。為(wei)驗(yan)證(zheng)該InDel是否(fou)影響TtOTS1的m6A甲基(ji)(ji)化(hua)水平，本研究針對變異位點上下游50bp序(xu)(xu)列進行MeRIP-qPCR檢測以(yi)排除其(qi)他潛在突(tu)變位點和RRACH基(ji)(ji)序(xu)(xu)干擾。結果顯示僅在ins-AACT單倍(bei)型材料(liao)中檢測到m6A修(xiu)飾(shi)（圖(tu)6f）。此外，TtOTS1作為(wei)eQTL（chr4B:418554622_418866532，P值(zhi)=1.03×10^-50）的eGene，其(qi)區間內(nei)包含一(yi)個(ge)m6A閱讀蛋(dan)白(bai)基(ji)(ji)因（TtECT6），提示m6A修(xiu)飾(shi)可(ke)能(neng)介導(dao)TtOTS1調控二粒小麥的DT性(xing)狀。

圖6 TtOTS1賦(fu)予二粒小麥耐旱性

此(ci)外，研(yan)究團(tuan)隊成功構(gou)建了TtOTS1的(de)病(bing)毒誘導基因沉默株系(xi)（BSMV:OTS）和功能缺失突變(bian)(bian)株系(xi)（ots1），并用于探究其抗旱(han)性。通過定量逆(ni)轉錄聚(ju)合酶鏈式反(fan)應和桑格(ge)測序(xu)技術(shu)，驗(yan)證了VIGS株系(xi)和突變(bian)(bian)株系(xi)中(zhong)TtOTS1表達的(de)下調(diao)（圖7a,b）。表型分析發現(xian)，在干旱(han)條件下，與(yu)野生型（WT）相(xiang)比，TtOTS1沉默植(zhi)株和翻(fan)譯提前終止突變(bian)(bian)體均(jun)表現(xian)出(chu)更(geng)高的(de)生物量抗旱(han)指數（DTI-BM）（圖7c-e）。進一步研(yan)究表明，干旱(han)處理下沉默株和突變(bian)(bian)株的(de)根(gen)長抗旱(han)指數（DTI-RL）顯(xian)著(zhu)高于野生型，其根(gen)系(xi)呈現(xian)更(geng)發達更(geng)深的(de)形態特(te)征（圖7f），證實(shi)TtOTS1通過調(diao)控根(gen)系(xi)構(gou)型負向調(diao)控抗旱(han)性。土壤培養實(shi)驗(yan)也(ye)顯(xian)示ots1突變(bian)(bian)體具有(you)更(geng)強的(de)抗旱(han)能力（圖S12a,b），再次驗(yan)證了TtOTS1的(de)功能。

研(yan)究(jiu)進(jin)一步對正常供水（WW）和(he)水分脅迫（WS）條件下的VIGS植株進(jin)行轉(zhuan)錄組測(ce)序(xu)及(ji)脫落酸（ABA）含(han)量測(ce)定(ding)(ding)（圖7g-i）。共鑒定(ding)(ding)到(dao)3439個差異(yi)表(biao)(biao)達基因(yin)（DEGs，其中1700個上調、1739個下調），這些基因(yin)顯著(zhu)富集(ji)于(yu)活性氧(yang)（ROS）代(dai)謝(xie)途(tu)徑、激素(su)信號轉(zhuan)導（ABA和(he)生長素(su)等）及(ji)根系發(fa)育相關(guan)通(tong)路。綜合(he)研(yan)究(jiu)結果表(biao)(biao)明，TtOTS1作為二粒小(xiao)麥抗(kang)旱(han)性的負調控因(yin)子發(fa)揮作用（圖7j），該發(fa)現為通(tong)過(guo)基因(yin)組編(bian)輯技術(shu)改良小(xiao)麥抗(kang)旱(han)性提供了潛在靶點。

圖7 沉默TtOTS1基(ji)因增強了(le)二粒小(xiao)麥的耐旱(han)性。

總結(jie)

本研(yan)究通過(guo)整合(he)全基(ji)因(yin)組關聯分析(GWAS)和(he)表(biao)達數(shu)量性狀位點分析(eGWAS)策略(lve)，系統(tong)解析了二(er)(er)(er)粒(li)小(xiao)麥(mai)(mai)(mai)耐旱(han)(han)(han)性(DT)的遺(yi)傳(chuan)(chuan)基(ji)礎。研(yan)究發現107份二(er)(er)(er)粒(li)小(xiao)麥(mai)(mai)(mai)材(cai)料(liao)的三個亞群在(zai)耐旱(han)(han)(han)指數(shu)(DTIs)上(shang)無顯(xian)著差異。然而在(zai)水分脅(xie)(xie)迫(WS)條(tiao)件下(xia)，野生(sheng)二(er)(er)(er)粒(li)小(xiao)麥(mai)(mai)(mai)(WEW)材(cai)料(liao)的變(bian)(bian)(bian)異系數(shu)(CV)顯(xian)著增(zeng)加(jia)，而栽培二(er)(er)(er)粒(li)小(xiao)麥(mai)(mai)(mai)(DEW)和(he)硬粒(li)小(xiao)麥(mai)(mai)(mai)(DW)材(cai)料(liao)變(bian)(bian)(bian)化(hua)甚微(wei)或有所(suo)降(jiang)低。這(zhe)些(xie)結果(guo)表(biao)明WEW材(cai)料(liao)對干(gan)旱(han)(han)(han)脅(xie)(xie)迫的響(xiang)應具(ju)有更(geng)高(gao)變(bian)(bian)(bian)異性，這(zhe)與前人(ren)研(yan)究結果(guo)一(yi)致。這(zhe)不僅有助于更(geng)好地(di)理解二(er)(er)(er)粒(li)小(xiao)麥(mai)(mai)(mai)耐旱(han)(han)(han)性的遺(yi)傳(chuan)(chuan)基(ji)礎，為更(geng)好地(di)改(gai)良和(he)選育抗旱(han)(han)(han)二(er)(er)(er)粒(li)小(xiao)麥(mai)(mai)(mai)與面(mian)包小(xiao)麥(mai)(mai)(mai)提(ti)供(gong)了重要遺(yi)傳(chuan)(chuan)資源。

參考文(wen)獻：Yang G, Pan Y, Pan W, et al. Combined GWAS and eGWAS reveals the genetic basis underlying drought tolerance in emmer wheat (Triticum turgidum L.). New Phytol. 2024 Jun;242(5):2115-2131. doi: 10.1111/nph.19589.