研究物種：小鼠

發(fa)表期刊：Molecular Medicine

發表時間：2024年

影響因子(zi)：6

HOT

文(wen)章亮點

創新性研究方(fang)法(fa)：文章采(cai)用了(le)一種結合傳統中藥與現代生物(wu)信息學技(ji)術的(de)方法，對王氏經驗(yan)方在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）治療中的(de)作(zuo)用機制(zhi)進行了(le)深入探討。這種跨學科的(de)研(yan)究方式為理(li)(li)解(jie)中藥復方的(de)作(zuo)用機理(li)(li)提供(gong)了(le)新(xin)的(de)視角。

明確靶點與(yu)路徑：研究表(biao)明，王氏經驗(yan)方能夠(gou)通過調節Toll樣(yang)受體4 (TLR4)、核因(yin)子(zi)κB (NF-κB) 以及(ji)環氧化酶2 (COX2) 這(zhe)條信號傳導路徑來發(fa)揮其抗NAFLD效果。這(zhe)不僅明確(que)了藥物作用的(de)具體分(fen)子(zi)靶標，也(ye)為(wei)未來開發(fa)更(geng)有效的(de)治療方法指明了方向。

全面的數據(ju)支(zhi)持：研究中使用了大(da)量的實驗數(shu)據和計算(suan)分析(xi)結果(guo)作為(wei)證據支撐(cheng)，包括但不限于基因表達譜分析(xi)、蛋白質互作網絡構建(jian)等，這些都極大(da)地增強了結論的可(ke)靠性和科學性。

潛在臨床應用價值：通過對王氏經(jing)驗方抗(kang)NAFLD機制的(de)解析，該研(yan)(yan)究(jiu)為尋找(zhao)新的(de)治(zhi)療策(ce)略(lve)提供了理論依(yi)據(ju)，并可能促進相關藥物的(de)研(yan)(yan)發進程，具(ju)有重要(yao)的(de)臨床轉(zhuan)化意義。

強調(diao)個(ge)性化醫療的重要性：雖(sui)然主要討論(lun)的(de)是特定配(pei)方的(de)作(zuo)用機制，但文中(zhong)也提到了不同(tong)個(ge)體(ti)間可(ke)能存在差異，暗(an)示了未(wei)來在NAFLD治(zhi)療上(shang)實施更加個(ge)性(xing)化的(de)醫療方案的(de)可(ke)能性(xing)。

總(zong)之，這篇論文通過綜合(he)運用多種先進(jin)技(ji)術手段，揭示了(le)一個傳統(tong)中藥方劑對(dui)抗(kang)NAFLD的新穎機制，對(dui)于推動中醫藥現代化及提(ti)高(gao)NAFLD患者的生活質(zhi)量具(ju)有重要(yao)意義。

研究背(bei)景

眾所周知，自從(cong)進入21世紀以來(lai)，隨著人(ren)們飲食結構和生(sheng)活習慣的改變，由營(ying)養(yang)過(guo)剩和代謝紊亂(luan)所引起的非酒(jiu)精性脂肪肝(gan)(gan)（NAFLD）已然成為(wei)(wei)(wei)全球最為(wei)(wei)(wei)常見的慢性肝(gan)(gan)病之一。據統計，在中(zhong)國(guo)，高(gao)達29.81%的成年人(ren)患有(you)NAFLD。根據估(gu)算，中(zhong)國(guo)2030年NAFLD患者的數量可能高(gao)達3.15億。而重(zhong)度NAFLD或(huo)非酒(jiu)精性脂肪性肝(gan)(gan)炎（NASH）可能進一步進展為(wei)(wei)(wei)肝(gan)(gan)衰(shuai)竭、肝(gan)(gan)硬化甚至肝(gan)(gan)癌(ai)，對人(ren)們的生(sheng)命健康造成極大(da)威脅(xie)。更為(wei)(wei)(wei)迫切(qie)的是(shi)，目前還沒(mei)有(you)藥(yao)物能夠有(you)效和完全地治(zhi)療NAFLD。

中(zhong)醫(yi)藥(yao)是(shi)(shi)中(zhong)華傳統文化的瑰寶，而中(zhong)醫(yi)經(jing)(jing)驗方則凝聚了名老中(zhong)醫(yi)多年(nian)臨(lin)床(chuang)實踐的經(jing)(jing)驗與(yu)智慧。本研(yan)究正是(shi)(shi)挑選(xuan)了Wang Kun-Gen教(jiao)授(shou)在中(zhong)醫(yi)治療NAFLD時所使用的經(jing)(jing)驗方（WSF）作為研(yan)究對象，結合一系(xi)列實驗方法和生(sheng)信分析對其進(jin)行研(yan)究的。

研究思(si)路

研究方法(fa)

質譜藥物成分(fen)(fen)分(fen)(fen)析，網絡藥理學，分(fen)(fen)子實驗

研究結果

1.WSF可減(jian)輕小鼠NAFLD

研(yan)究(jiu)者(zhe)使用(yong)了(le)高(gao)(gao)糖(tang)、高(gao)(gao)脂飲食方案構(gou)建了(le)ICR小鼠(shu)NAFLD模(mo)型，并(bing)設置(zhi)了(le)對照組(zu)和(he)多烯(xi)磷脂酰膽堿（PPC）陽性對照組(zu)。研(yan)究(jiu)結果顯(xian)(xian)示(shi)，相較(jiao)于(yu)NAFLD模(mo)型組(zu)小鼠(shu)，給(gei)予WSF或(huo)PPC給(gei)藥(yao)均能顯(xian)(xian)著(zhu)降低小鼠(shu)體質量、附(fu)睪脂肪指(zhi)數及(ji)其質量，且肝(gan)臟指(zhi)數及(ji)其質量也(ye)呈下降的(de)趨勢。通過基于(yu)H&E和(he)ORO染色(se)的(de)組(zu)織病理學檢查(cha)，研(yan)究(jiu)者(zhe)發(fa)現PPC和(he)WSF給(gei)藥(yao)均能顯(xian)(xian)著(zhu)緩(huan)解由高(gao)(gao)糖(tang)、高(gao)(gao)脂飲食所(suo)造(zao)成的(de)肝(gan)損(sun)傷(shang)(shang)和(he)脂滴累積(ji)。同時，血清AST和(he)ALT水(shui)平(ping)也(ye)顯(xian)(xian)著(zhu)下降，這些指(zhi)標常(chang)作為(wei)衡量肝(gan)損(sun)傷(shang)(shang)的(de)血清生(sheng)化指(zhi)標。研(yan)究(jiu)者(zhe)進(jin)一(yi)步(bu)關注了(le)WSF對于(yu)糖(tang)脂代謝(xie)的(de)影響。通過檢測血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU等指(zhi)標，明確(que)了(le)WSF可(ke)顯(xian)(xian)著(zhu)改善NAFLD小鼠(shu)的(de)糖(tang)脂代謝(xie)，達到了(le)與PPC相似甚(shen)至更強的(de)療(liao)效(xiao)。上述研(yan)究(jiu)結果顯(xian)(xian)示(shi)WSF可(ke)顯(xian)(xian)著(zhu)緩(huan)解小鼠(shu)NAFLD，有進(jin)一(yi)步(bu)研(yan)究(jiu)其分子機制(zhi)的(de)價值。

圖1：WSF對NAFLD小鼠體質量(liang)和(he)內(nei)臟脂肪積累的影響

圖2：WSF對NAFLD小鼠肝臟功能及其病(bing)理學特性的影響

2.基于高(gao)效液相色譜(pu)-質譜(pu)聯用分析WSF的化學成分組成

從事藥理學(xue)及相(xiang)關研(yan)究(jiu)方(fang)(fang)(fang)(fang)向的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)者(zhe)應(ying)該清楚(chu)，如果某種(zhong)單(dan)體藥物(wu)(wu)表(biao)(biao)型(xing)非常(chang)明確，下一步(bu)可基于(yu)單(dan)體結構(gou)開展分(fen)(fen)(fen)析(xi)。然(ran)而，以中(zhong)醫(yi)經(jing)驗方(fang)(fang)(fang)(fang)等為代表(biao)(biao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)中(zhong)醫(yi)復(fu)方(fang)(fang)(fang)(fang)由于(yu)藥味組成(cheng)(cheng)復(fu)雜(za)、化學(xue)成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)(fen)繁多，對于(yu)其分(fen)(fen)(fen)子機制的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)具有較大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)不確定(ding)性，且可重復(fu)性往往較差。因(yin)此，對復(fu)方(fang)(fang)(fang)(fang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)化學(xue)成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)(fen)檢測是必不可少的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，只有明確了(le)(le)復(fu)方(fang)(fang)(fang)(fang)主(zhu)要成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組成(cheng)(cheng)，研(yan)究(jiu)成(cheng)(cheng)果才有說(shuo)服(fu)力(li)。高效(xiao)液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)(pu)-質譜(pu)(pu)聯用(yong)（HPLC-MS）是一種(zhong)將高效(xiao)液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)(pu)（HPLC）與質譜(pu)(pu)（MS）結合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)析(xi)技術。這種(zhong)技術結合(he)了(le)(le)色(se)譜(pu)(pu)和(he)質譜(pu)(pu)二者(zhe)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)優點，可連(lian)續完成(cheng)(cheng)樣本的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)離和(he)定(ding)性/定(ding)量分(fen)(fen)(fen)析(xi)，我們可以將HPLC看作MS的(de)(de)(de)(de)(de)(de)進樣裝置，也可以將MS看作HPLC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)析(xi)裝置，二者(zhe)取(qu)長(chang)補短，相(xiang)得益彰。該研(yan)究(jiu)所使用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)HPLC-Q-TOF/MS更適用(yong)于(yu)定(ding)性而非定(ding)量分(fen)(fen)(fen)析(xi)。分(fen)(fen)(fen)別在正(zheng)、負離子模式下獲取(qu)WSF的(de)(de)(de)(de)(de)(de)總離子流圖，經(jing)過(guo)與化學(xue)結構(gou)數據庫比對和(he)文獻分(fen)(fen)(fen)析(xi)，共識(shi)別到39種(zhong)潛在的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)活性成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)(fen)，糖苷類(lei)(lei)、生(sheng)物(wu)(wu)堿類(lei)(lei)、苯丙素(su)類(lei)(lei)、酚(fen)酸類(lei)(lei)化合(he)物(wu)(wu)等。研(yan)究(jiu)者(zhe)希望基于(yu)這些化合(he)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結構(gou)，通過(guo)網(wang)絡藥理學(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)(fang)(fang)法預測其分(fen)(fen)(fen)子機制。

圖3：HPLC-MS正(zheng)、負離子模式下的(de)WSF化學(xue)成分分析(xi)總離子流圖

3.網絡(luo)藥理學和分子(zi)對(dui)接探索(suo)WSF抗NAFLD的分子(zi)機制

除了HPLC-MS所(suo)(suo)篩選到的(de)39種(zhong)成分以外，研究者還從文(wen)獻和數據庫中(zhong)搜集了一(yi)些(xie)WSF各藥味(wei)所(suo)(suo)包含的(de)化(hua)合(he)物作為補充。將總計(ji)72種(zhong)化(hua)合(he)物導入Swiss Target Prediction平臺進行靶(ba)點預測。該平臺所(suo)(suo)采用(yong)的(de)算法可(ke)結(jie)(jie)合(he)小分子(zi)與(yu)蛋白質(zhi)的(de)結(jie)(jie)構，計(ji)算那些(xie)可(ke)能的(de)結(jie)(jie)合(he)模(mo)式，并給予一(yi)項評(ping)分來評(ping)估對應小分子(zi)-蛋白質(zhi)產生互作的(de)可(ke)靠性(xing)。

經預測和(he)篩選，共(gong)獲取878個靶(ba)蛋白，將這(zhe)些靶(ba)蛋白與來源(yuan)于OMIM、GeneCards、DisGENET數據庫中的(de)NAFLD相關靶(ba)點取交集，共(gong)得到254個交集靶(ba)點，即WSF有可能作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)于這(zhe)些靶(ba)點發揮抗NAFLD作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)。

進一步使用Cytoscape軟件構建WSF成分-交集(ji)靶點(dian)(dian)(dian)互作網絡，并通過軟件內置的(de)Network Analyzer分析網絡的(de)拓(tuo)撲(pu)(pu)學屬(shu)性(xing)，挑選(xuan)(xuan)那些(xie)Degree值更高的(de)靶點(dian)(dian)(dian)；同時利用STRING數據庫生成交集(ji)靶點(dian)(dian)(dian)的(de)蛋白互作網絡，使用CentiScape 2.2 插件進行拓(tuo)撲(pu)(pu)學分析、Cytoscape軟件進行可視化，綜(zong)合考慮多個拓(tuo)撲(pu)(pu)學參(can)數，如(ru)Degree值、Betweenness centrality值、Closeness centrality值等，篩選(xuan)(xuan)關(guan)鍵靶點(dian)(dian)(dian)，所篩靶點(dian)(dian)(dian)包(bao)括(kuo)TNF、IL6、AKT1、IL1B、PPARG等。

圖(tu)4：通過網(wang)絡藥(yao)理學探(tan)索WSF抗NAFLD的潛(qian)在分子機制(zhi)

進一(yi)步利用DAVID數據(ju)庫(ku)進行KEGG和GO生(sheng)物富集(ji)分(fen)析(xi)，將所預測(ce)得到(dao)的(de)(de)靶蛋(dan)白進行富集(ji)，發現WSF的(de)(de)抗NAFLD作用很有可(ke)能與(yu)(yu)NF-κB信(xin)號(hao)通(tong)路、TLR信(xin)號(hao)通(tong)路相(xiang)關。為(wei)了增(zeng)加網(wang)絡藥理(li)學預測(ce)結(jie)(jie)果的(de)(de)可(ke)靠(kao)性(xing)，研究者對(dui)TLR4、NF-κB、COX-2等重點關注的(de)(de)靶蛋(dan)白與(yu)(yu)WSF中主(zhu)要的(de)(de)生(sheng)物活(huo)性(xing)成(cheng)分(fen)進行了分(fen)子(zi)對(dui)接分(fen)析(xi)，計(ji)算其結(jie)(jie)合(he)能，發現大多數蛋(dan)白受體(ti)及其配體(ti)之間的(de)(de)結(jie)(jie)合(he)能均(jun)低(di)于(yu)-5 kcal/mol。以JGL8組分(fen)與(yu)(yu)COX-2蛋(dan)白的(de)(de)分(fen)子(zi)對(dui)接結(jie)(jie)果為(wei)例，JGL8可(ke)結(jie)(jie)合(he)到(dao)軟件(jian)所計(ji)算到(dao)的(de)(de)COX-2蛋(dan)白活(huo)性(xing)口袋，與(yu)(yu)其ASN-39、CYS-47、SER-49等8個(ge)氨基酸殘(can)基形成(cheng)氫(qing)鍵，穩定結(jie)(jie)合(he)。這些結(jie)(jie)果說明配受體(ti)之間具有良好的(de)(de)親和力，即網(wang)絡藥理(li)學預測(ce)結(jie)(jie)果較為(wei)可(ke)靠(kao)。

圖5：通過分(fen)子對接初步(bu)驗(yan)證網絡藥理學所預測的(de)靶蛋白與(yu)小(xiao)分(fen)子單(dan)體(ti)之(zhi)間的(de)結合能(neng)力

4.利用(yong)免疫組織化學、Elisa和(he)Western Blot進行分子機制驗證(zheng)

在基(ji)于免疫組(zu)織化學的(de)驗(yan)(yan)證實驗(yan)(yan)中(zhong)，研究者分析了(le)(le)肝(gan)組(zu)織TLR4、NF-κB、COX-2和IL-6的(de)蛋白(bai)水(shui)平(ping)，發(fa)(fa)現(xian)(xian)這些(xie)(xie)蛋白(bai)在小鼠(shu)(shu)NAFLD造模后顯著(zhu)(zhu)(zhu)升高(gao)，而WSF給藥后顯著(zhu)(zhu)(zhu)降低；在Elisa實驗(yan)(yan)中(zhong)，發(fa)(fa)現(xian)(xian)WSF給藥能顯著(zhu)(zhu)(zhu)降低NAFLD小鼠(shu)(shu)肝(gan)臟IL-1β和TNF-α的(de)水(shui)平(ping)；在Western Blot實驗(yan)(yan)中(zhong)，發(fa)(fa)現(xian)(xian)WSF給藥可顯著(zhu)(zhu)(zhu)降低小鼠(shu)(shu)肝(gan)臟TLR、NF-κB和COX-2的(de)蛋白(bai)表達水(shui)平(ping)。這些(xie)(xie)結果驗(yan)(yan)證了(le)(le)上述(shu)分子機(ji)制預測的(de)靶點，說明WSF很(hen)有可能通過靶向TLR4/NF-κB/COX2途徑(jing)，影響IL-1β、IL-6產生，最終緩解NAFLD。

圖6：Western Blot檢測WSF給藥(yao)后部分靶(ba)蛋白的變化水(shui)平(ping)

圖7：免疫組織化學和Elisa檢(jian)測WSF給(gei)藥(yao)后部分靶蛋白的(de)變(bian)化水(shui)平

結論

該(gai)研究選取了(le)WSF作為研究對象，利用NAFLD小鼠模型闡明其藥(yao)理活性(xing)。而后(hou)通過HPLC-MS分(fen)析(xi)WSF的(de)化(hua)學(xue)(xue)成(cheng)分(fen)組成(cheng)，并基于這些化(hua)學(xue)(xue)成(cheng)分(fen)通過網絡藥(yao)理學(xue)(xue)和分(fen)子對接探索WSF抗NAFLD潛(qian)在的(de)分(fen)子機(ji)制，最后(hou)通過免疫組織化(hua)學(xue)(xue)、Elisa和Western Blot對一些關鍵的(de)靶蛋白進行驗證。該(gai)研究為中醫(yi)經驗方開展(zhan)研究和中醫(yi)藥(yao)現代化(hua)提供了(le)參考，值得學(xue)(xue)習(xi)。而該(gai)研究的(de)不足則(ze)在于對分(fen)子機(ji)制的(de)驗證較(jiao)為局限(xian)，期待該(gai)研究團隊的(de)后(hou)續成(cheng)果。