2017-03-01
以(yi)PacBio公司的SMRT單分子實(shi)時測(ce)序技術（Single molecule real-time sequencing）為代表的三(san)代測(ce)序技(ji)術，通過其獨有的環形(xing)一致(zhi)性測(ce)序模式（Circular-consensus sequence，CCS），極大提高(gao)單堿(jian)基測序(xu)的準確率，遠超(chao)Illumina等(deng)二代測序技術。與(yu)傳(chuan)統轉錄組測序項目相比，利用(yong)PacBio平(ping)臺的(de)全(quan)長轉錄組測序技術(shu)可以直(zhi)接獲得mRNA的(de)全長，保證了(le)mRNA序列的精確性。近期我們將陸續推出全長轉錄組測序技術相關文章，供討論和交流。我們在上一期向大家介紹了全長轉錄組測序的技術(shu)原(yuan)理和實驗流(liu)程，本期將為大家介紹全長轉錄組測序分析流程中的數據整理和質控。
分析(xi)流程
首先從(cong)下機數據(ju)中提取Reads of Insert（RoI）序列，根據Reads of Insert序列是(shi)否含(han)3’ 端引物(wu)和5’端引物以及是(shi)否(fou)嵌合對Reads of Insert進(jin)行分類(lei)(lei)，對(dui)(dui)全長(chang)序列進(jin)行去(qu)冗余(yu)聚類(lei)(lei)，并(bing)用非(fei)全長(chang)序列對(dui)(dui)其進(jin)行校(xiao)正。接著將非(fei)冗余(yu)序列比對(dui)(dui)到該物種(zhong)的參考基因組(zu)上(shang)，在此基礎上(shang)完成(cheng)融合基因分析(xi)，并(bing)進(jin)行比對(dui)(dui)結果整理，根據比對(dui)(dui)結果與參考基因組(zu)的注釋(shi)信息對(dui)(dui)Isoform進行(xing)功能注(zhu)釋，并完成基因結構優(you)化(hua)。另(ling)外，我(wo)們還進行(xing)了轉錄本結構分(fen)析(xi)，包括可變剪(jian)接分(fen)析(xi)， UTR區域注釋，cSNP 和InDel 分析等。
數據整理(li)和質控
每個原(yuan)始序(xu)列可(ke)以分(fen)割成一個或多個子序(xu)列（Subread，Subread 是DNA聚合(he)酶(mei)以一條(tiao)模板鏈經過一個Passes合成(cheng)的(de)，不包括Adapter序列），即每個(ge)零(ling)模波導孔中(zhong)會有多個(ge)Subreads。每個(ge)零(ling)模波導(dao)孔中(zhong)的所有Subreads來自同一個(ge)轉錄本(ben)，由于其(qi)堿基出(chu)錯率是隨(sui)機的，可通過(guo)Subreads間比對提高堿基質量，獲得一條(tiao)Reads of Insert，即Reads of Insert通過同一零(ling)模波導孔(kong)中的Subreads校正后得(de)到。
對原始下機數據進行提取(qu)和過濾Subreads，去除Adapter和(he)低質量的序列。為(wei)了充分(fen)利用數據(ju)，篩選(xuan)出長(chang)度大(da)于50bp、序列(lie)準確度大于0.8并且Full Passes數目(mu)大于0的序(xu)列，得到Reads of Insert，如圖1。一個Full passes指(zhi)原始(shi)序(xu)列中的一條子序(xu)列兩端均含有 Adapter（圖(tu)中(zhong)黑色區域），一(yi)個原始序(xu)列的Full passes數目指在該序列中文庫cDNA序列被完整測到的次數，圖1中有Full passes數目為2。
圖(tu)1 Reads of Insert示(shi)意圖
我們對每(mei)個樣品(pin)的Reads of Insert按不(bu)同(tong)插入片段長度分別進行統計，包括RoI序列數目、RoI總堿基量、RoI序列平(ping)均長度(du)、RoI序列平(ping)均質量和平(ping)均Passes。整理好的(de)數(shu)據就可以開展后續的(de)分析了，具體(ti)分析內容將在下一期進行闡述，敬請期待。
