研究(jiu)物種：小鼠

發表期刊： Journal of Advanced Research

發表時間：2022年

影響因子：11.4

文(wen)章(zhang)亮(liang)點(dian)

針對(dui)“超級細(xi)菌”MRSA的有(you)效活性(xing)：

研究聚焦于耐(nai)甲(jia)氧西林金黃色葡萄球菌(jun) (MRSA)，這是一種臨(lin)床危害極(ji)大的(de)多重耐(nai)藥“超級(ji)細菌(jun)”，對許多常用抗(kang)生素耐(nai)藥，亟需新型抗(kang)菌(jun)藥物。

文章(zhang)證明了苦參（Sophora flavescens）中特定的薰衣草基(ji)化黃酮類化合物 (lavandulylated flavonoids) 對 MRSA 具有顯著的抗(kang)菌活性，為對抗(kang)這種難治性感染提供了潛在的天然來源候(hou)選分子。

特定(ding)結構化合物的作用：

研究不是籠(long)統地(di)研究苦參提取(qu)物，而是精確定(ding)位到具(ju)有(you)薰衣草基（lavandulyl group）修飾的(de)黃酮(tong)類化合物（如(ru) leachianone G, sophoraflavanone G 等）。這突出了特定(ding)化學結構（薰衣草基化）對于抗 MRSA 活性的(de)關鍵作用。

明確(que)的(de)作用機制：破壞細胞膜

文章(zhang)最大的(de)亮點之一是通過多種實驗方(fang)法（如(ru)掃描/透射電鏡觀(guan)察形態(tai)、細(xi)胞內容物泄漏檢測、膜電位(wei)測定、膜流動性測定等）明確揭示(shi)了這些(xie)化合物的(de)主要(yao)作用機制(zhi)是破(po)壞細(xi)菌細(xi)胞膜。

具(ju)體表現(xian)為：導致(zhi)細胞膜出(chu)現(xian)孔洞/損傷、增加膜通透性（內容物泄漏）、破壞膜電位、降低(di)膜流動性（使(shi)膜更“僵硬”）。

膜破(po)壞機(ji)制的(de)(de)優勢： 這種物(wu)理性的(de)(de)膜破(po)壞作用機(ji)制通(tong)常(chang)被認(ren)為不易誘發(fa)細菌產生(sheng)傳統途(tu)徑的(de)(de)耐藥性（不同于(yu)靶向(xiang)特定蛋白的(de)(de)抗生(sheng)素），具有重要的(de)(de)潛(qian)在應用價值(zhi)。

膜破壞導致細菌死亡的關(guan)鍵過程(cheng)：

研究(jiu)不僅證(zheng)明膜(mo)破(po)壞(huai)，還闡明了由(you)此引發的細(xi)(xi)菌死(si)亡過(guo)程(cheng)：膜(mo)破(po)裂導致胞內重要物質（如 ATP、K?、核酸等）泄漏 → 能量代謝崩潰（ATP 耗盡）→ 最終導致細(xi)(xi)菌死(si)亡。這(zhe)構成了一個比較完(wan)整(zheng)的機制鏈(lian)條。

天然產(chan)物對抗耐藥菌的潛力：

該研究為(wei)從中藥/天(tian)然(ran)產(chan)物中發現(xian)新(xin)型抗(kang)菌劑以應對日益嚴重的(de)抗(kang)生(sheng)素耐(nai)藥性問題提供了有力的(de)證據和(he)范(fan)例。薰衣草基化(hua)黃酮作(zuo)為(wei)天(tian)然(ran)成分，其抗(kang) MRSA 活(huo)性和(he)獨特機(ji)制具有重要的(de)研究價值。

為(wei)(wei)藥(yao)物開(kai)發提供基礎：這(zhe)些特定的(de)薰衣草基化黃酮(tong)類(lei)化合物，憑借其抗 MRSA 的(de)有(you)效(xiao)性和(he)明確的(de)膜(mo)破壞機制，可(ke)以作為(wei)(wei)先導化合物，用于后續(xu)的(de)藥(yao)物化學優化和(he)新藥(yao)開(kai)發研究(jiu)。

研(yan)究背景

在(zai)我(wo)國(guo)，天(tian)然植(zhi)物(wu)一直是(shi)藥(yao)物(wu)的寶貴來源，比如短萼(e)黃連可(ke)(ke)以治療霍亂(luan)，青蒿素可(ke)(ke)以治療瘧疾，黃芩提取物(wu)可(ke)(ke)以殺滅沙門氏(shi)菌(jun)(jun)等(deng)，表明(ming)傳統(tong)中(zhong)藥(yao)材有(you)(you)著巨(ju)大(da)的基(ji)礎(chu)醫學(xue)(xue)研(yan)(yan)究潛力。巧(qiao)妙(miao)鏈接傳統(tong)中(zhong)藥(yao)材與現代醫學(xue)(xue)基(ji)礎(chu)研(yan)(yan)究，應用(yong)最新(xin)組學(xue)(xue)技術平臺，主動瞄準具有(you)(you)明(ming)顯(xian)臨床意義(yi)課題，已成為當前(qian)研(yan)(yan)究熱點。隨著耐藥(yao)細菌(jun)(jun)不斷涌(yong)現并且迅速蔓(man)延，由(you)此產生(sheng)了(le)研(yan)(yan)發新(xin)型抗(kang)生(sheng)素的迫(po)切需求，而天(tian)然植(zhi)物(wu)中(zhong)可(ke)(ke)能含有(you)(you)多種抗(kang)菌(jun)(jun)成分，是(shi)發現新(xin)型抗(kang)生(sheng)素的重要(yao)來源。本研(yan)(yan)究深入探(tan)討苦參中(zhong)兩種黃酮(tong)類化合(he)物(wu)對耐受甲(jia)氧(yang)西林的金(jin)黃色葡萄(tao)球菌(jun)(jun)（MRSA）的抗(kang)菌(jun)(jun)作用(yong)及相關(guan)機制。

研究(jiu)方法(fa)

蛋(dan)白組，代謝組

技術路線

研究結果

1. 用SFG或KE治療的金(jin)黃色葡萄(tao)球菌(jun)的蛋白質組學分(fen)析

在這項研究中(zhong)，使(shi)用無標(biao)記的(de)定(ding)量(liang)蛋白(bai)質(zhi)組學技術來對用SFG或KE處理的(de)MRSA進行蛋白(bai)質(zhi)組學研究（圖(tu)(tu)1A）。我們通(tong)過光譜分析確定(ding)了21,098肽(tai)，其中(zhong)14,634個(ge)是特定(ding)的(de)肽(tai)。大多數已鑒定(ding)的(de)肽(tai)分布在7-20個(ge)氨(an)基(ji)酸內，該氨(an)基(ji)酸遵循質(zhi)譜片段化模式的(de)一般規則和(he)質(zhi)量(liang)控制的(de)需求（圖(tu)(tu)B）。

與對照組(zu)相比，我們(men)在SFG組(zu)中鑒定了(le)45種(zhong)上(shang)調(diao)(diao)的(de)蛋(dan)白質和(he)33種(zhong)下調(diao)(diao)蛋(dan)白，在KE組(zu)中鑒定了(le)17種(zhong)上(shang)調(diao)(diao)的(de)蛋(dan)白質和(he)40個下調(diao)(diao)的(de)蛋(dan)白質（圖(tu)1C-E）。分層群(qun)集分析顯(xian)示，對照組(zu)和(he)治療組(zu)的(de)DEP之間存在顯(xian)著差異（圖(tu)1F）。基因本(ben)體論（GO）注釋表明，生物學過程(cheng)高度富含細胞和(he)代謝過程(cheng)，大多(duo)數DEP參與催化活(huo)性和(he)結(jie)合（圖(tu)D）。

圖 1. 用SFG或KE治療(liao)的(de)金黃色葡(pu)萄球(qiu)菌的(de)蛋白質(zhi)組學分析。

2.蛋白(bai)質組差(cha)異蛋白(bai)功能富集結(jie)果

直系同源組(zu)（COG）分(fen)(fen)析(xi)的(de)簇表明，DEP主(zhu)要(yao)參與碳水化(hua)合(he)(he)物和(he)(he)氨(an)基酸(suan)的(de)能源生產和(he)(he)轉化(hua)，運輸和(he)(he)代(dai)謝(xie)(xie)(xie)，細胞(bao)壁(bi)/膜/包(bao)膜生物發生以(yi)(yi)及細胞(bao)分(fen)(fen)裂（圖2A和(he)(he)B）。此外，KEGG途徑富集(ji)分(fen)(fen)析(xi)表明，這些深度與以(yi)(yi)下途徑有關：金黃色葡(pu)萄球菌感染(ran)；丙氨(an)酸(suan)，天冬(dong)氨(an)酸(suan)和(he)(he)谷(gu)氨(an)酸(suan)代(dai)謝(xie)(xie)(xie)；氮(dan)代(dai)謝(xie)(xie)(xie)；精氨(an)酸(suan)生物合(he)(he)成(cheng)；酪氨(an)酸(suan)代(dai)謝(xie)(xie)(xie)；丁烷新陳代(dai)謝(xie)(xie)(xie)；萘降解；脂肪酸(suan)降解和(he)(he)嘌呤代(dai)謝(xie)(xie)(xie)（圖2C和(he)(he)D）。

圖 2.蛋白(bai)質組差(cha)異蛋白(bai)功能富集結果

3.用SFG或KE處理的MRSA的代謝(xie)組分析(xi)

在(zai)本研究中(zhong)，基于(yu)UPLC-QTOF/MS系統(tong)和(he)(he)(he)多元統(tong)計分(fen)(fen)析的(de)(de)(de)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)組學方法用(yong)于(yu)分(fen)(fen)析用(yong)SFG或KE處理的(de)(de)(de)MRSA細胞中(zhong)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)物(wu)光(guang)譜的(de)(de)(de)擾動。根據(ju)OPLS-DA模型(xing)選擇(ze)了(le)分(fen)(fen)化的(de)(de)(de)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)物(wu)（DMS）。對照組和(he)(he)(he)治(zhi)(zhi)療組均(jun)表現出(chu)明確的(de)(de)(de)聚集行為。每個組中(zhong)的(de)(de)(de)所有重復都分(fen)(fen)為相同(tong)的(de)(de)(de)簇，證實了(le)對照組和(he)(he)(he)治(zhi)(zhi)療組之(zhi)間的(de)(de)(de)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)譜的(de)(de)(de)差異（圖(tu)(tu)(tu)3A和(he)(he)(he)B，圖(tu)(tu)(tu)S3A和(he)(he)(he)B）。在(zai)SFG組中(zhong)總共定(ding)義了(le)192個顯(xian)著改變的(de)(de)(de)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)產(chan)物(wu)，其(qi)中(zhong)148種代(dai)(dai)謝(xie)(xie)產(chan)物(wu)被下(xia)調(diao)，44個代(dai)(dai)謝(xie)(xie)產(chan)物(wu)上調(diao)。在(zai)KE組中(zhong)，鑒定(ding)出(chu)189個顯(xian)著改變的(de)(de)(de)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)產(chan)物(wu)，其(qi)中(zhong)132個代(dai)(dai)謝(xie)(xie)產(chan)物(wu)被下(xia)調(diao)，57個代(dai)(dai)謝(xie)(xie)產(chan)物(wu)上調(diao)（VIP> 1，p-value <0.05）（圖(tu)(tu)(tu)3 C和(he)(he)(he)D，圖(tu)(tu)(tu)S3C和(he)(he)(he)D，圖(tu)(tu)(tu)S3C和(he)(he)(he)D，圖(tu)(tu)(tu)S4）。 KEGG富(fu)集分(fen)(fen)析表明，DMS主要參與氨(an)基酸(suan)和(he)(he)(he)脂肪酸(suan)代(dai)(dai)謝(xie)(xie)途(tu)徑（圖(tu)(tu)(tu)3E和(he)(he)(he)圖(tu)(tu)(tu)S3 E）。

圖(tu) 3. 用SFG或(huo)KE處理的MRSA的代謝組分(fen)析

4. SFG和KE對生(sheng)物膜(mo)和細胞壁合成的(de)影響

在(zai)(zai)這項研(yan)究中，我(wo)們(men)評估了在(zai)(zai)不(bu)同濃度下(xia)用SFG或KE處理的(de)MRSA（USA300）的(de)生物膜形成(cheng)。如圖(tu)4A所示(shi)，SFG和(he)(he)KE均(jun)以劑量(liang)依賴(lai)性方式(shi)表現出對MRSA生物膜的(de)顯(xian)著抑(yi)制作用（P<0.001）。 QRT-PCR分析的(de)結果表明，SFG或KE處理后MRSA中ICAA基因(yin)的(de)下(xia)調（圖(tu)4B）。通常，這些結果表明SFG和(he)(he)KE對MRSA生物膜的(de)形成(cheng)具有強大的(de)抑(yi)制作用。

圖 4. SFG和(he)KE發揮作(zuo)用，并調(diao)節與細胞壁生物合(he)成，蛋白質轉運和(he)葡萄糖代(dai)謝(xie)相關(guan)的基因的表達。

5. SFG和KE在MRSA細胞膜(mo)上的功效

透(tou)射(she)電(dian)(dian)鏡和膜電(dian)(dian)位(wei)檢測(ce)結(jie)果(guo)發現SFG和KE可(ke)能會引起MRSA細(xi)胞的(de)(de)DW和滲透(tou)壓的(de)(de)顯著變化(hua)。隨后，膜穩(wen)態(tai)的(de)(de)破壞會導(dao)致氧(yang)化(hua)應激和ROS積累。在(zai)本研(yan)究中，使用DCFH-DA熒光(guang)探針測(ce)量(liang)ROS的(de)(de)產生(sheng)。像許(xu)多(duo)殺(sha)菌抗生(sheng)素一樣(yang)，SFG或KE處理以劑量(liang)依賴性方式誘導(dao)ROS的(de)(de)過度積累（圖5H）。這些結(jie)果(guo)表(biao)明，SFG和KE對(dui)MRSA的(de)(de)細(xi)胞膜造成了(le)重大損(sun)害，并可(ke)能引起氧(yang)化(hua)應激反應以產生(sheng)過度的(de)(de)ROS，從而進一步導(dao)致細(xi)胞死亡。

圖(tu) 5. SFG和KE通過(guo)破壞(huai)細胞膜(mo)發揮抗菌作用(yong)

6. SFG和KE在能(neng)源生產和轉(zhuan)換(huan)中的(de)功效(xiao)

SFG和(he)(he)KE的(de)生(sheng)(sheng)產可以減少MRSA和(he)(he)MRSP Embden-Meyerhof途徑（EMP），并構成(cheng)了(le)MRIND和(he)(he)EMP。在SFG或KE的(de)壓力下，MRSA的(de)膜(mo)滲透性發生(sheng)(sheng)了(le)變化，導致ATP的(de)大量(liang)泄漏，MRSA的(de)能(neng)量(liang)代謝受到干擾(rao)，最終導致了(le)細胞損傷(shang)和(he)(he)死亡。

圖(tu) 6. 能量生產和(he)轉(zhuan)化途徑(jing)中的蛋(dan)白質和(he)代(dai)謝物的改變(bian)

7. SFG和KE在氮和氨(an)基酸代(dai)謝上的功效(xiao)

我們發現SFG和(he)(he)KE對(dui)MRSA的(de)(de)(de)氮和(he)(he)氨(an)(an)(an)(an)基酸(suan)(suan)(suan)(suan)代謝(xie)具(ju)有重(zhong)大影響(xiang)(xiang)。與(yu)硝酸(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)還原至氨(an)(an)(an)(an)的(de)(de)(de)關鍵催化酶(mei)(mei)NAR G和(he)(he)NIR B顯(xian)著(zhu)下(xia)調（P <0.01）。抑(yi)(yi)制此過程可能會(hui)降低細胞內氨(an)(an)(an)(an)水(shui)，這是谷(gu)(gu)氨(an)(an)(an)(an)酰(xian)胺(an)(an)和(he)(he)谷(gu)(gu)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)合(he)成的(de)(de)(de)關鍵成分(fen)。另外(wai)，抑(yi)(yi)制谷(gu)(gu)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)合(he)成將(jiang)進一步影響(xiang)(xiang)精氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)合(he)成。蛋(dan)白質組學的(de)(de)(de)結果表明，谷(gu)(gu)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)脫(tuo)氫(qing)酶(mei)(mei)（GUDB），谷(gu)(gu)氨(an)(an)(an)(an)酰(xian)胺(an)(an)合(he)成酶(mei)(mei)（GLNA），氨(an)(an)(an)(an)基甲酸(suan)(suan)(suan)(suan)酯激酶(mei)(mei)（ARCC）和(he)(he)鳥(niao)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)碳氨(an)(an)(an)(an)甲酰(xian)胺(an)(an)型(xing)轉移酶(mei)(mei)（ARGF）的(de)(de)(de)表達顯(xian)著(zhu)下(xia)調（圖7A，表S2和(he)(he)S3）。相應地，代謝(xie)組學結果顯(xian)示(shi)，用(yong)SFG和(he)(he)KE處理的(de)(de)(de)MRSA中谷(gu)(gu)氨(an)(an)(an)(an)酰(xian)胺(an)(an)，谷(gu)(gu)氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，瓜氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)精氨(an)(an)(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)(suan)水(shui)平顯(xian)著(zhu)降低（圖7B-E）（p <0.01）。總(zong)之(zhi)，SFG和(he)(he)KE可能會(hui)干(gan)擾(rao)MRSA對(dui)硝酸(suan)(suan)(suan)(suan)鹽(yan)(yan)的(de)(de)(de)利用(yong)并抑(yi)(yi)制氨(an)(an)(an)(an)基酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)(de)(de)合(he)成，從(cong)而導致MRSA能量代謝(xie)的(de)(de)(de)破壞。

圖 7. 氮代謝(xie)和精氨(an)酸生物合成途徑中改變的蛋白質和代謝(xie)物的改變。

8. SFG和KE在小鼠皮膚傷口(kou)感染模型上的功效

為了(le)進(jin)一步探索SFG和(he)KE對(dui)細(xi)(xi)菌性(xing)傳(chuan)染(ran)病的(de)(de)潛在(zai)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)作用，我們建立了(le)小(xiao)(xiao)鼠傷(shang)口感染(ran)模型。如圖8A和(he)B所示，MRSA感染(ran)后，未經(jing)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)的(de)(de)傷(shang)口愈合緩慢，在(zai)第3天出現化膿性(xing)傷(shang)口。然(ran)(ran)而，SFG和(he)KE顯(xian)著(zhu)(zhu)促進(jin)了(le)傷(shang)口閉合，抑(yi)(yi)制了(le)膿液分泌。SFG或(huo)KE治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)后傷(shang)口大小(xiao)(xiao)顯(xian)著(zhu)(zhu)減(jian)小(xiao)(xiao)（P<0.001）。同時(shi)，感染(ran)區域的(de)(de)細(xi)(xi)菌數量(liang)減(jian)少了(le)近十倍（圖8C，與SFG相(xiang)比P<0.01，與KE相(xiang)比P<0.05）。此(ci)外，在(zai)整個(ge)實驗(yan)期間，SFG和(he)KE顯(xian)著(zhu)(zhu)抑(yi)(yi)制了(le)促炎(yan)細(xi)(xi)胞因子IL-6的(de)(de)水平（圖8D，P<0.05）。H&E染(ran)色顯(xian)示，未治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)組的(de)(de)傷(shang)口有更多的(de)(de)炎(yan)性(xing)細(xi)(xi)胞和(he)壞(huai)死組織(zhi)。然(ran)(ran)而，SFG和(he)KE可(ke)以減(jian)少炎(yan)性(xing)細(xi)(xi)胞浸潤，促進(jin)血管新生（圖8E）。綜上所述，這些結果表明SFG和(he)KE可(ke)以有效治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)MRSA引起的(de)(de)皮膚感染(ran)。

圖8. SFG和KE在傷口感染(ran)模型中(zhong)發揮了(le)有(you)希望的治(zhi)療(liao)潛力。

研究結論(lun)

綜上所述，本研究表明，天然植物(wu)中的(de)(de)黃酮(tong)對MRSA具有很好(hao)的(de)(de)抗菌活(huo)性。SFG和KE都可能(neng)是開發新的(de)(de)抗生(sheng)素藥(yao)物(wu)來對抗細菌相關性感(gan)染的(de)(de)潛(qian)在候選者。

文章索引

Weng Z, Zeng F, Wang M, Guo S, Tang Z, Itagaki K, Lin Y, Shen X, Cao Y, Duan JA, Wang F. Antimicrobial activities of lavandulylated flavonoids in Sophora flavences against methicillin-resistant Staphylococcus aureus via membrane disruption. J Adv Res. 2024 Mar;57:197-212. doi: 10.1016/j.jare.2023.04.017. Epub 2023 May 1. PMID: 37137428; PMCID: PMC10918359