文章題目：Multi-omics analyses of the ulcerative colitis gut microbiome link Bacteroides vulgatus proteases with disease severity
中文標題：多組學用于潰瘍性結腸炎(yan)腸道菌群中(zhong)普(pu)通擬桿菌蛋(dan)白酶(mei)關聯(lian)疾病嚴重程度(du)的研究
發表期刊：Nature Microbiology
影響因子：19.4
發表時間：2022.01
樣本類型：人糞便樣(yang)本和血清樣(yang)本
組學技術：宏蛋(dan)白(bai)組(zu)學、宏基因組(zu)測序、16S多樣性、代(dai)謝組(zu)學
研究背景
潰(kui)瘍性結腸炎（UC, Ulcerative colitis），是一種炎癥(zheng)性腸病(bing)(IBD, inflammatory bowel disease)，以結腸的(de)(de)(de)慢性炎癥(zheng)為特(te)征(zheng)，黏膜炎癥(zheng)的(de)(de)(de)嚴重程(cheng)度、持(chi)續性與(yu)發病(bing)率和死亡(wang)率相關。UC是由宿(su)主-菌群(qun)穩態的(de)(de)(de)破壞(huai)引起的(de)(de)(de)。針對宿(su)主的(de)(de)(de)非特(te)異性免疫抑(yi)制(zhi)劑，如類固醇(chun)、硫(liu)嘌(piao)呤和/或生物制(zhi)劑，可用于抵消中重度炎癥(zheng)患者的(de)(de)(de)自然病(bing)程(cheng)。然而，這些治療方法與(yu)重大風險相關，并(bing)且在(zai)充(chong)分管理(li)疾病(bing)方面往往無(wu)效(xiao)。有許多(duo)基(ji)于基(ji)因組(zu)(zu)技術的(de)(de)(de)微(wei)生物組(zu)(zu)研究已經確定(ding)了與(yu)UC的(de)(de)(de)關聯，強調了與(yu)UC狀態相關的(de)(de)(de)微(wei)生物失衡(heng)和組(zu)(zu)成的(de)(de)(de)時間變(bian)化。雖然最近的(de)(de)(de)研究將UC的(de)(de)(de)微(wei)生物群(qun)分析擴(kuo)展到了基(ji)因組(zu)(zu)學之(zhi)外，但仍(reng)然不清楚這些變(bian)化在(zai)本質上(shang)是因果關系(xi)還(huan)是關聯關系(xi)。
研究思路
1.發現隊列：40名潰瘍性結腸炎(yan)（UC）患者(zhe)的(de)糞(fen)便和血清(qing)的(de)組學數據集；獨(du)立驗證隊列，210份(fen)糞(fen)便樣本，包括 73例UC患者(zhe)，117 份(fen)克羅恩(en)病（CD）患者(zhe)，20份(fen)炎(yan)癥性腸病（IBD）患者(zhe)。
2.整合兩個隊列的數據，研究與UC疾病(bing)嚴重性相關(guan)的微生物群落的變化情況。
3.使用Caco-2細胞模型測(ce)試UC中六種豐度最高的擬桿菌對(dui)腸(chang)道屏(ping)障的影(ying)響，并測(ce)試了廣譜蛋(dan)白酶(mei)抑制劑的效果。
4.結合蛋白組學和代(dai)謝(xie)組學對糞便和血(xue)清樣本進行分析(xi)，從而識別與UC疾病相關的(de)微(wei)生物蛋白質和代(dai)謝(xie)產物。
研究內容
1、宏組學數據與 IBD 嚴重程度的關聯
雖(sui)然該研究(jiu)選用(yong)的(de)隊列人群來自不(bu)同的(de)患者(zhe)群體，但許多(duo)(duo)臨床嚴(yan)重程度相(xiang)(xiang)關的(de)指(zhi)標(biao)顯示(shi)出高度的(de)相(xiang)(xiang)關性(xing)(xing)(xing)。因此，選擇(ze)了(le)‘partial Mayo’作為 UC 患者(zhe)臨床活(huo)動(dong)性(xing)(xing)(xing)的(de)代(dai)表性(xing)(xing)(xing)指(zhi)標(biao)。臨床指(zhi)標(biao)與多(duo)(duo)組學(xue)(xue)數(shu)(shu)(shu)據(ju)結(jie)合分析顯示(shi)，疾病嚴(yan)重程度與腸道菌群的(de) α-多(duo)(duo)樣性(xing)(xing)(xing)和 β-多(duo)(duo)樣性(xing)(xing)(xing)都具有顯著相(xiang)(xiang)關性(xing)(xing)(xing)。該研究(jiu)團隊進一步(bu)分析發現，宏蛋白(bai)組學(xue)(xue)的(de)數(shu)(shu)(shu)據(ju)能夠最好(hao)的(de)預(yu)測 UC 活(huo)性(xing)(xing)(xing)，其次(ci)是多(duo)(duo)組學(xue)(xue)整合的(de)數(shu)(shu)(shu)據(ju)和代(dai)謝組學(xue)(xue)的(de)數(shu)(shu)(shu)據(ju)。同時，在活(huo)動(dong)性(xing)(xing)(xing) UC 患者(zhe)中，還觀察到(dao)了(le)人源蛋白(bai)質增加(jia)，以及與活(huo)動(dong)性(xing)(xing)(xing)相(xiang)(xiang)關的(de)代(dai)謝物類(lei)別。
組學(xue)多樣(yang)性與 IBD 疾病(bing)活(huo)動度相關
IBD 疾病活(huo)動性相(xiang)關的多組學分析
2、綜合宏基因組-宏蛋白質組學分析揭示了擬桿菌蛋白酶區分活動性UC患者亞群
利(li)用線性回歸模型確定了與(yu)臨床疾(ji)(ji)病(bing)(bing)嚴重程度(du)最相(xiang)關(guan)的(de)(de)多組(zu)學數(shu)據(ju)特征(zheng)。從關(guan)聯(lian)的(de)(de)菌(jun)屬中(zhong)(zhong)發(fa)現擬桿菌(jun)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白水平占與(yu) UC 疾(ji)(ji)病(bing)(bing)活(huo)性正相(xiang)關(guan)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白的(de)(de)40%-60%，這一關(guan)聯(lian)性在兩個 UC 隊列(lie)中(zhong)(zhong)得到(dao)證實，并且是(shi) UC 患者(zhe)人群中(zhong)(zhong)獨(du)有(you)的(de)(de)特征(zheng)。進一步的(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白功能分析發(fa)現，酶(mei)(mei)家族(zu)的(de)(de)比(bi)率很高，其中(zhong)(zhong) B. vulgatus 和(he)(he) B. dorei 蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白酶(mei)(mei)占所有(you)擬桿菌(jun)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白酶(mei)(mei)總(zong)量的(de)(de)40%。該研究團隊采用一種異(yi)常值(zhi)方(fang)法，將 B. vulgatus 和(he)(he) B. dorei 宏(hong)(hong)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)豐度(du)與(yu)來自 B. vulgatus 和(he)(he) B. dorei 蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白酶(mei)(mei)的(de)(de)總(zong)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白豐度(du)進行(xing)比(bi)較，以(yi)確定存在高于(yu)或低于(yu)宏(hong)(hong)基(ji)因(yin)(yin)組(zu)學預期蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白酶(mei)(mei)存在的(de)(de) UC 患者(zhe)組(zu)。因(yin)(yin)此推測(ce)這些蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白酶(mei)(mei)在胞外(wai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白水解和(he)(he)疾(ji)(ji)病(bing)(bing)活(huo)動加(jia)劇中(zhong)(zhong)發(fa)揮(hui)作用。
整合宏(hong)基因組-宏(hong)蛋白質組分析揭(jie)示擬桿(gan)菌肽(tai)蛋白酶區分活躍UC患者的一個亞群
3、UC患者組學和擬桿菌上清中蛋白水解的評估
代謝(xie)組(zu)學(xue)(xue)和(he)宏肽組(zu)學(xue)(xue)分(fen)析證實了(le)蛋(dan)白(bai)(bai)水(shui)解在UC患者(zhe)(zhe)(zhe)中的(de)(de)(de)(de)重(zhong)要性(xing)(xing)。最初(chu)是(shi)通過(guo)鑒定二肽豐(feng)度觀察到的(de)(de)(de)(de)，二肽豐(feng)度是(shi)與(yu)UC疾病活性(xing)(xing)相關(guan)(guan)性(xing)(xing)第二高的(de)(de)(de)(de)代謝(xie)物(wu)類(lei)(lei)(lei)別(bie)(bie)。二肽和(he)寡肽是(shi)與(yu)疾病活性(xing)(xing)正相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)(de)代謝(xie)產(chan)物(wu)中最常見的(de)(de)(de)(de)兩個化學(xue)(xue)類(lei)(lei)(lei)別(bie)(bie)（r > 0.3）分(fen)別(bie)(bie)占總正相關(guan)(guan)的(de)(de)(de)(de)44%和(he)5.8%。為了(le)進一步分(fen)析寡肽，本研究采(cai)用從頭測序的(de)(de)(de)(de)方法分(fen)析了(le)宏肽組(zu)學(xue)(xue)（來自復雜(za)的(de)(de)(de)(de)多(duo)物(wu)種樣(yang)本的(de)(de)(de)(de)多(duo)肽。結果在嚴重(zhong)UC的(de)(de)(de)(de)糞便(bian)樣(yang)本和(he)擬桿菌屬蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)生產(chan)過(guo)剩(sheng)的(de)(de)(de)(de)患者(zhe)(zhe)(zhe)中發現(xian)了(le)更多(duo)的(de)(de)(de)(de)肽片段。該數據還揭示了(le)來自人類(lei)(lei)(lei)蛋(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)(de)(de)肽片段的(de)(de)(de)(de)身份，包括來自膠原和(he)粘蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)結構蛋(dan)白(bai)(bai)。這些人類(lei)(lei)(lei)蛋(dan)白(bai)(bai)是(shi)UC蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)的(de)(de)(de)(de)潛在靶標。已知的(de)(de)(de)(de)中性(xing)(xing)粒細(xi)胞彈性(xing)(xing)蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)和(he)蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)-327的(de)(de)(de)(de)切割模式并不是(shi)識別(bie)(bie)肽末(mo)端的(de)(de)(de)(de)強(qiang)信號(hao)，這表明(ming)中性(xing)(xing)粒細(xi)胞蛋(dan)白(bai)(bai)酶(mei)可能不是(shi)患者(zhe)(zhe)(zhe)蛋(dan)白(bai)(bai)水(shui)解的(de)(de)(de)(de)主(zhu)要貢(gong)獻者(zhe)(zhe)(zhe)。
評估UC患者和擬(ni)桿菌上清的蛋(dan)白質水解作(zuo)用
4、蛋白酶抑制在體外和體內均可抑制普通擬桿菌誘導的結腸上皮損傷
使用結腸(chang)上(shang)皮細胞(bao)系(xi) Caco-2 制(zhi)備(bei)單(dan)層細胞(bao)膜測(ce)試(shi)了 UC 中六種最(zui)豐富的(de)(de)(de)擬(ni)(ni)桿(gan)菌對(dui)腸(chang)道屏障的(de)(de)(de)影(ying)響。結果表明，兩種最(zui)豐富的(de)(de)(de)擬(ni)(ni)桿(gan)菌屬物(wu)(wu)種（B. vulgatus 和(he) B.dorei）孵育(yu)38小時(shi)后(hou)，跨上(shang)皮細胞(bao)電阻（TEER）顯(xian)著(zhu)(zhu)降低。考慮到 B. vulgatus 在 UC 腸(chang)道微生物(wu)(wu)群比(bi)健康腸(chang)道微生物(wu)(wu)群中的(de)(de)(de)豐度更高，因此被選擇進(jin)行重點研(yan)究。接(jie)下來，通(tong)過添(tian)加絲氨(an)(an)酸(suan)和(he)半(ban)胱氨(an)(an)酸(suan)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)抑制(zhi)劑(ji)(ji)混合物(wu)(wu)來評估(gu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)活(huo)性對(dui)上(shang)皮通(tong)透性破(po)壞的(de)(de)(de)貢獻(xian)。結果發現，在接(jie)種 B. vulgatus 后(hou)22小時(shi)和(he)38小時(shi)，蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)抑制(zhi)劑(ji)(ji)顯(xian)著(zhu)(zhu)增加 TEER，且使用或(huo)(huo)不(bu)使用蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)抑制(zhi)劑(ji)(ji)混合物(wu)(wu)處理的(de)(de)(de) B. vulgatus 集(ji)落(luo)形成沒有顯(xian)著(zhu)(zhu)差異。進(jin)一步實驗發現 B. vulgatus 上(shang)清(qing)液對(dui) TEER 沒有顯(xian)著(zhu)(zhu)影(ying)響，表明目標蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)酶(mei)(mei)是膜結合的(de)(de)(de)或(huo)(huo)者其分泌需要應激源（例如，宿主-微生物(wu)(wu)相互作用或(huo)(huo)營養剝(bo)奪）的(de)(de)(de)刺激。
蛋(dan)白酶抑(yi)制對B. vulgatus和(he)糞便移(yi)植誘導的(de)體外和(he)體內病(bing)理有保護作用
5、UC患者糞便中存在的B.vulgatus蛋白酶將結腸炎嚴重程度移植到無菌小鼠
為了評估 UC 患(huan)者(zhe)中(zhong)(zhong)高(gao)水(shui)平(ping)的(de)(de) B. vulgatus 蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)存在對腸(chang)道炎癥發展的(de)(de)影響程度。將 UC 患(huan)者(zhe)（含(han)有(you)或(huo)不含(han)有(you)高(gao)水(shui)平(ping) B. vulgatus 蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)）的(de)(de)糞(fen)(fen)便(bian)移(yi)(yi)植(zhi)(zhi)到易患(huan)結(jie)(jie)腸(chang)炎的(de)(de) IL10-/- 無菌小(xiao)鼠(shu)(shu)。這些小(xiao)鼠(shu)(shu)中(zhong)(zhong)有(you)一半通過飲(yin)用水(shui)給予(yu)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑混合(he)物（n = 9）。給予(yu)富含(han)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)糞(fen)(fen)便(bian)樣品(pin)的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)(shu)顯(xian)示出(chu) UC 相關的(de)(de)病理(li)指標，而(er)這些表型(xing)在移(yi)(yi)植(zhi)(zhi)缺乏 B. vulgatus 蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de) UC 患(huan)者(zhe)糞(fen)(fen)便(bian)的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)(shu)中(zhong)(zhong)并不明顯(xian)。同時，蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑混合(he)物顯(xian)著(zhu)減輕了移(yi)(yi)植(zhi)(zhi)蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)豐富的(de)(de)糞(fen)(fen)便(bian)樣品(pin)的(de)(de)小(xiao)鼠(shu)(shu)表現(xian)出(chu)的(de)(de)結(jie)(jie)腸(chang)炎。因此建議蛋白(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)作(zuo)為重度 UC 的(de)(de)治療干預手(shou)段(duan)。
糞便移植實驗的額外(wai)測量
研究結論
本研(yan)究(jiu)通過整合糞便宏蛋白(bai)(bai)(bai)質組學(xue)、代謝(xie)組學(xue)、16S擴增子測序(xu)、鳥(niao)槍法宏基因組學(xue)、宏肽組學(xue)和(he)血(xue)清蛋白(bai)(bai)(bai)質組學(xue)，以及體(ti)外(wai)(wai)和(he)體(ti)內驗證(zheng)，證(zheng)明了(le)(le)微生物組中的某(mou)些成員，如B. vulgatus，可能(neng)通過蛋白(bai)(bai)(bai)酶活性加劇UC疾病的活動。此外(wai)(wai)，鑒于本研(yan)究(jiu)的體(ti)外(wai)(wai)和(he)體(ti)內實驗的前景(jing)，為進一步研(yan)究(jiu)擬桿菌屬蛋白(bai)(bai)(bai)酶抑制作為UC治療方法奠定了(le)(le)基礎。
