研究物種：小鼠

發表期刊：Carbohydrate Polymers

發表時間：2023年

影響因子：12.5

文章亮點

• 創新性地發(fa)現并證(zheng)實了Usp10是羊肚(du)菌多糖（MEP）保肝作用的(de)關鍵上游靶點。

• 系統闡明了MEP通(tong)過激(ji)活Usp10，一(yi)方面抑制(zhi)NF-κB炎癥(zheng)通(tong)路，另一(yi)方面激(ji)活Nrf2抗氧化通(tong)路，從(cong)而(er)協同發揮強大(da)保肝作(zuo)用的分子機制(zhi)。

• 利用嚴謹的基因(yin)敲低/敲除實驗驗證了(le)Usp10在(zai)此機(ji)制中的核心(xin)樞紐(niu)作用。

• 為天然產(chan)物保肝(gan)機制研究開辟了新視(shi)角，并(bing)提升了羊肚菌作為保肝(gan)功(gong)能(neng)性(xing)資(zi)源(yuan)的(de)應用價值。

研究背景

酒(jiu)精性(xing)肝(gan)(gan)病(bing)（ALD）是(shi)由長(chang)期過量飲(yin)酒(jiu)引起的，其特征是(shi)脂(zhi)肪在肝(gan)(gan)臟中積聚，并逐漸發展為(wei)脂(zhi)肪變(bian)性(xing)，伴有炎癥、肝(gan)(gan)纖維化和肝(gan)(gan)硬化。全球超過7500萬人患有酒(jiu)精使用障礙，患酒(jiu)精相(xiang)關(guan)肝(gan)(gan)病(bing)的風險很高。酒(jiu)精及其代(dai)謝產物促進腸(chang)道微(wei)生態失(shi)調，增(zeng)加腸(chang)道通(tong)透性(xing)，并誘導細菌產物從(cong)腸(chang)道轉移到肝(gan)(gan)臟，從(cong)而誘導促炎因子的產生，從(cong)而促進ALD的發展。

羊肚(du)菌（Morchella esculenta，ME）是一種高營養價值(zhi)的獨特藥用(yong)和(he)食用(yong)同源真(zhen)菌，主(zhu)要生長在(zai)中(zhong)(zhong)國、韓(han)國、日本(ben)和(he)歐洲(zhou)闊葉或混交針葉林(lin)的腐殖(zhi)質層中(zhong)(zhong)。ME主(zhu)要用(yong)于(yu)治療消化不良、痰相關疾(ji)病和(he)呼吸急促(cu)。在(zai)酒精(jing)誘導的急性肝損傷(shang)小鼠模型中(zhong)(zhong)，ME通過(guo)調節NF-kB/Nrf2信號(hao)通路具有(you)肝臟保護作用(yong)。然(ran)而，MEP在(zai)慢性酒精(jing)性肝損傷(shang)中(zhong)(zhong)的詳(xiang)細結構和(he)療效分析及其潛在(zai)機(ji)制尚(shang)未系統(tong)報(bao)道(dao)。本(ben)研究基于(yu)對腸道(dao)微生物組(zu)(zu)、代謝組(zu)(zu)和(he)蛋(dan)白質組(zu)(zu)分析，為MEP2在(zai)慢性酒精(jing)誘導的肝損傷(shang)中(zhong)(zhong)的應用(yong)提供(gong)了實驗(yan)證據。

研究思路

研究方法

微生物組(zu)(zu)、轉(zhuan)錄(lu)組(zu)(zu)、蛋白質組(zu)(zu)

研究結果

MEP2的純化與結構表征

使用DEAE-52色譜(pu)柱純化MEP（圖1A），并分析了MEP-A、MEP-B和MEP-C對(dui)酒精誘導的(de)細(xi)胞損(sun)傷的(de)保(bao)護作用。MEP-A和MEP-B均在HepG2細(xi)胞中(zhong)表現出(chu)較強的(de)保(bao)護作用（圖1B）。MEP2由單糖Glc（90.971%）、Gal（0.161%）、Man（0.145%）和Glc-UA（0.094%）組成(cheng)（圖1G）。分子量（Mw）為510至980 kDa的(de)多糖是(shi)MEP2的(de)主要成(cheng)分（約63.4%，圖1H）。MEP2的(de)平均Mw為959 kDa（圖1I）。

采用(yong)核磁共(gong)振波譜進一步分(fen)析了MEP2的(de)結構特(te)征。利(li)用(yong)掃描電鏡觀察MEP2的(de)微觀結構和形貌特(te)征。大多數(shu)MEP2殘(can)基具有紙狀結構，只(zhi)有少數(shu)殘(can)基呈棒狀或線圈狀，表明MEP2具有無定形結構（圖2）。

圖1. MEP2的純(chun)化和初級結構表征

圖2. 利用核磁(ci)共(gong)振和掃描電鏡對(dui)MEP2進行(xing)結構(gou)表征

MEP2改善了慢性酒精性肝損傷小鼠的病理和生化改變

長期(qi)飲(yin)酒(jiu)抑(yi)制(zhi)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠體重(zhong)增(zeng)(zeng)加，與CTRL小(xiao)(xiao)(xiao)鼠相比(bi)(bi)，心(xin)臟、肝臟、肺(fei)和(he)(he)腎臟指標升高，脾臟指數和(he)(he)胸腺降低。長期(qi)酒(jiu)精攝入導致小(xiao)(xiao)(xiao)鼠肝細(xi)胞索(suo)紊亂(luan)、肝細(xi)胞腫(zhong)脹(zhang)、脂肪液泡數量增(zeng)(zeng)加、炎癥細(xi)胞浸潤和(he)(he)肝細(xi)胞核數量減少，這些都被MEP2和(he)(he)Sil強(qiang)烈逆(ni)轉(zhuan)（圖(tu)(tu)3A）。試驗(yan)組均未(wei)發現心(xin)、肺(fei)、脾、腎、腦、胸腺有明顯變(bian)化；與載體處(chu)理的(de)酒(jiu)精給藥(yao)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠相比(bi)(bi)，在慢性酒(jiu)精誘導的(de)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠中，MEP2強(qiang)烈抑(yi)制(zhi)天冬氨(an)(an)酸氨(an)(an)基(ji)轉(zhuan)移酶(mei)，丙氨(an)(an)酸氨(an)(an)基(ji)轉(zhuan)移酶(mei)，γ-谷氨(an)(an)酰轉(zhuan)移酶(mei)和(he)(he)CYP2E1并增(zeng)(zeng)加肝臟ADH水平和(he)(he)醛脫氫酶(mei)（圖(tu)(tu)3B-F）。

圖3. MEP2在(zai)慢性酒(jiu)精誘導小鼠中(zhong)顯示出(chu)肝(gan)臟保護作用

MEP2 改變了慢性酒精誘導小鼠的腸道微生物

在CTRL、載體處理酒(jiu)精給(gei)藥(yao)組(zu)和MEP2處理酒(jiu)精給(gei)藥(yao)組(zu)中(zhong)，總(zong)共(gong)分別發(fa)現了(le)6304個（25.99%）、6297個（25.96%）和7409個（30.55%）獨有(you)OTUs，在所有(you)組(zu)中(zhong)發(fa)現了(le)1514個（6.24%）共(gong)有(you)OTUs（圖(tu)4A）。MEP2給(gei)藥(yao)促進擬桿(gan)菌(jun)的(de)增(zeng)殖至(zhi)(zhi)52.63%，并將厚壁菌(jun)的(de)相對豐度降低至(zhi)(zhi)40.76%（圖(tu)4B）。此外，還分析了(le)三(san)組(zu)中(zhong)豐度變化最(zui)大的(de)前20個細菌(jun)屬（圖(tu)4C-G）。

使用MetaCyc數據庫(ku)對酒(jiu)(jiu)精(jing)給藥組和(he)MEP2處理的(de)(de)酒(jiu)(jiu)精(jing)給藥組之(zhi)間與改(gai)變的(de)(de)腸道(dao)細菌(jun)相(xiang)關的(de)(de)代(dai)謝途徑進行分析(xi)。在8條一級功(gong)(gong)能(neng)通路中，分析(xi)了58條二級功(gong)(gong)能(neng)通路，脂(zhi)肪酸(suan)和(he)脂(zhi)質生物合成、TCA循環、醇降解、脂(zhi)肪酸(suan)和(he)脂(zhi)質降解和(he)醛降解與肝臟酒(jiu)(jiu)精(jing)代(dai)謝有關（圖4H）。

圖(tu)4. MEP2調節慢性酒精誘導小鼠腸道菌(jun)群

MEP2改變了慢性酒精誘導的肝損傷小鼠血清中的代謝物水平

實驗組共檢出血清代(dai)(dai)謝(xie)產物(wu)1035種(zhong)，包括脂(zhi)質和類脂(zhi)分子，有(you)機酸及(ji)其(qi)衍生物(wu)。KEGG富集分析顯(xian)示MEP2改變了22條代(dai)(dai)謝(xie)途徑，分別與(yu)氨基酸代(dai)(dai)謝(xie)、碳水(shui)化合物(wu)代(dai)(dai)謝(xie)、消化系統、癌癥代(dai)(dai)謝(xie)、信號(hao)轉(zhuan)導等(deng)有(you)關(guan)（圖 5A）。與(yu)載體(ti)處理的(de)(de)(de)酒精(jing)給藥組相(xiang)比，MEP2增加(jia)了一種(zhong)代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)的(de)(de)(de)水(shui)平，降低了13種(zhong)代(dai)(dai)謝(xie)物(wu)的(de)(de)(de)水(shui)平（圖5B）。血栓素(su)B2（TXB2）水(shui)平與(yu)白(bai)三(san)烯(xi)B4（LTB4）水(shui)平之間存在顯(xian)著的(de)(de)(de)正相(xiang)關(guan)關(guan)系（圖5C）。相(xiang)關(guan)性(xing)分析表(biao)明(ming)TXB2水(shui)平與(yu)食鹽(yan)桿菌(jun)豐(feng)(feng)度呈強正相(xiang)關(guan)，與(yu)脫鹽(yan)桿菌(jun)和瘤胃(wei)球菌(jun)豐(feng)(feng)度呈強負相(xiang)關(guan)，LTB4水(shui)平與(yu)乳酸桿菌(jun)和脫鹵桿菌(jun)豐(feng)(feng)度呈強負相(xiang)關(guan)（圖5D）。

圖5. MEP2調節慢性酒精誘導小鼠(shu)血清代謝物水平

蛋白質組學分析

GO富集分析顯(xian)示(shi)與線粒體功能相關的(de)(de)細胞(bao)成分以(yi)及(ji)與氧化還原(yuan)酶活性相關的(de)(de)分子(zi)功能（圖6A）。載體處(chu)理的(de)(de)酒(jiu)精給藥組中觀察到(dao)21種蛋白(bai)質（如Pafah1b2，Usp10和(he)Cldn3）的(de)(de)下(xia)調(diao)，MEP2強烈(lie)逆轉（圖6B）。MEP2抑制PAF受體，并增強了Usp10，Cldn3、1b2、Mtx2、Mrps2、Cox7c、Taco1（圖6C）。IHC結果進(jin)一步證(zheng)實(shi)，由MEP2誘導的(de)(de)慢性酒(jiu)精損(sun)傷(shang)小鼠的(de)(de)UsP10的(de)(de)肝臟水(shui)平(ping)升高（圖6D）和(he)PAFR的(de)(de)下(xia)降（圖6E）。

圖6慢性酒精誘導小鼠肝臟(zang)的蛋白質組學分析

MEP2減輕了慢性酒精誘導的肝損傷小鼠中與NF-κB相關的炎癥

酒(jiu)精(jing)性肝(gan)病的特征(zheng)是(shi)肝(gan)臟(zang)(zang)中巨噬細(xi)胞和中性粒細(xi)胞的募集和活化，釋放有害介(jie)質，從而(er)增加炎癥。長期飲酒(jiu)會(hui)提高腫(zhong)瘤壞死因(yin)子(zi)(TNF)-α的表(biao)達(da)水平，降低IL-6，NF-kB、IKK、IkBα、IL-10水平，但(dan)這些變化均被MEP2顯著逆(ni)轉（圖(tu)(tu)7A）。與載體處理酒(jiu)精(jing)給藥組(zu)相(xiang)比，MEP2導致(zhi)在小鼠的肝(gan)臟(zang)(zang)中干擾素(su)（IFN）-α，IFN-γ，TNF-α，IL-6和IL-17水平降低。IHC結果進一步證(zheng)實了(le)MEP2對慢性酒(jiu)精(jing)誘導小鼠肝(gan)臟(zang)(zang)磷酸化NF-kB水平的抑制作(zuo)用（圖(tu)(tu)7）。

圖(tu)7 MEP2抑制了小鼠酒精誘(you)導的(de)炎(yan)癥反應

MEP2 通過 Nrf2 改善氧化應激

與載體處理的(de)(de)酒精給藥小鼠相比，在慢性酒精誘導MEP2給藥小鼠的(de)(de)肝臟(zang)中(zhong)谷(gu)胱甘(gan)肽過氧化物酶(mei)（GSH-Px）、過氧化氫酶(mei)（CAT）和超氧化物歧化酶(mei)（SOD）水(shui)平(ping)均(jun)顯著(zhu)提(ti)高（圖(tu)8C-E），ROS和MDA水(shui)平(ping)顯著(zhu)降低(di)（圖(tu)8A-B）。WB結(jie)果顯示，Nrf2及其下游蛋白(bai)的(de)(de)表達(da)水(shui)平(ping)，包(bao)括CAT、NQO、HO-1、SOD-1在慢性酒精誘導小鼠的(de)(de)肝臟(zang)中(zhong)的(de)(de)表達(da)水(shui)平(ping)降低(di)，MEP2治療顯著(zhu)改(gai)善（圖(tu)8F）。IHC結(jie)果進一步證實了(le)(le)Nrf2表達(da)的(de)(de)增強（圖(tu)8G）。MEP2有效地(di)改(gai)善了(le)(le)氧化磷酸化，并抑(yi)制了(le)(le)長期飲(yin)酒引起的(de)(de)氧化應激損傷。

圖(tu)8 MEP2改善慢(man)性酒(jiu)精誘(you)導(dao)小(xiao)鼠肝臟中的氧化應激

結 論

從羊(yang)肚(du)菌中提(ti)取并純(chun)化了水(shui)溶(rong)性(xing)羊(yang)肚(du)菌多糖2（MEP2），分子量為(wei)959kDa的MEP2具有a→4)-α-D-Glcp-(1→葡聚(ju)糖主鏈，并且該(gai)分支(zhi)在(zai)H-6位置被α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→殘基(ji)和(he)α-D-Glcp-(1→殘基(ji)。在(zai)慢性(xing)酒精誘導的肝損(sun)傷小鼠中，MEP2通(tong)過Usp10/Nrf2/NF-kB信號通(tong)路調節血清代謝(xie)產物和(he)腸道微生(sheng)物群(qun)的水(shui)平，以抑制炎癥反(fan)應和(he)氧化應激，減輕肝損(sun)傷。這些數據(ju)支(zhi)持(chi)了MEP2作為(wei)酒精性(xing)肝損(sun)傷潛在(zai)治療策(ce)略的應用。

參考文獻

Shanshan Teng, Yongfeng Zhang, Xinghui Jin, Yanfeng Zhu , Lanzhou Li, Xiaowei Huang ,Di Wang , Zhe Lin. 2023. Structure and hepatoprotective activity of Usp10/NF-κB/Nrf2 pathway-related Morchella esculenta polysaccharide. Carbohydrate Polymers, 303, 120453. DOI:10.1016/j.carbpol.2022.120453.