在空(kong)間(jian)轉錄組技術中，樣(yang)本處理(li)(li)的(de)(de)每一個細節都直接影響(xiang)實驗結果的(de)(de)可靠性。從(cong)組織采集(ji)到測(ce)序前(qian)的(de)(de)質控(kong)，任何環節的(de)(de)疏漏都可能導致數(shu)據(ju)偏(pian)差甚(shen)至實驗失(shi)敗。本文將圍繞樣(yang)本處理(li)(li)全流程、質控(kong)標(biao)準、避坑指(zhi)南等展開，為您呈(cheng)現空(kong)間(jian)轉錄組樣(yang)本處理(li)(li)的(de)(de)標(biao)準。

一(yi)、空間轉(zhuan)錄組(zu)測序(xu)樣本準備(bei)與處理

1、空(kong)間轉錄組實(shi)驗設計與樣本重復數

（1）空間轉錄組(zu)實(shi)驗設(she)計和樣本(ben)選擇

①腫瘤疾病(bing)方向：

腫瘤(liu)vs正(zheng)常(chang)（癌(ai)旁）、腫瘤(liu)不同進展(zhan)時(shi)期、腫瘤(liu)不同區域、泛(fan)癌(ai)的組織樣本，揭(jie)示腫瘤(liu)發生發展(zhan)過程中(zhong)，樣本的空(kong)間異質性；

同(tong)治療(liao)方(fang)法(fa)和(he)不(bu)(bu)同(tong)預(yu)(yu)(yu)后程(cheng)度(du)設置組別取(qu)樣，比較不(bu)(bu)同(tong)治療(liao)方(fang)法(fa)（如手(shou)術、放療(liao)、化(hua)療(liao)）對腫瘤微環境的影(ying)響，探(tan)討(tao)治療(liao)效果的分子機制，及分析不(bu)(bu)同(tong)預(yu)(yu)(yu)后程(cheng)度(du) （如生存期(qi)長(chang)短(duan)） 的腫瘤患者(zhe)的空間轉錄組特征，尋找潛在的預(yu)(yu)(yu)后標志物。

②神經發(fa)育方向：

胚胎(tai)、腦、腸、肺等按照發育時期取(qu)樣(yang)，發育時期推薦至少3個取(qu)樣(yang)點，若通過(guo)其他研究已(yi)聚焦某(mou)個關鍵發育時期，可選取(qu)特定發育階段的組織樣(yang)本(ben)，揭示其背后的空(kong)間分子機(ji)制。

（2）空(kong)間轉錄組樣(yang)本重復設置建議

①區分生(sheng)物重(zhong)復與技術重(zhong)復：

生物重復：指不同(tong)(tong)來(lai)源的(de)獨(du)立個體(ti)（例(li)如，不同(tong)(tong)的(de)小鼠、不同(tong)(tong)的(de)病人樣本、來(lai)自同(tong)(tong)一個體(ti)的(de)不同(tong)(tong)器(qi)官/組織塊）。空間轉錄組實驗的(de)核(he)心(xin)是(shi)必(bi)須有足(zu)夠的(de)生物重復。

技術重復(fu)： 指同一(yi)份生物樣本在(zai)實驗流(liu)程（如(ru)切片、文庫(ku)構建、測序）中(zhong)的重(zhong)復處理。例如(ru)，對同一(yi)組織塊的相(xiang)鄰切片分別進行(xing)空間(jian)轉錄組檢測。

②設置生物重復(fu)數量(liang)的建議：

每(mei)組至(zhi)少3個，強烈推薦4-6個或更(geng)多獨立的(de)生物重復(fu)(fu)，是獲得可(ke)靠、可(ke)重復(fu)(fu)且有統計學意義(yi)結論的(de)基礎。

2、空間轉(zhuan)錄組樣本處(chu)理全流程

（1）樣(yang)本準備

①OCT包埋

新鮮組織樣本，建議在30min內包埋(mai)(mai)，取下后迅速用(yong)(yong)預冷的PBS溶液或(huo)者生理(li)鹽(yan)水沖洗組織表面(mian)殘(can)留(liu)，然后用(yong)(yong)干凈的吸(xi)(xi)水紙吸(xi)(xi)干液體。此步(bu)驟(zou)一定要吸(xi)(xi)干水分(fen)，如有(you)液體殘(can)留(liu)，OCT包埋(mai)(mai)后，組織表面(mian)形成冰晶(jing)，影響切片效果，整個樣本處理(li)過程需要保(bao)持低(di)溫(wen)環境。

注：包埋好后最好立即送(song)樣切(qie)片，暫時儲存可(ke)在-80℃存儲3個月(yue)內，可(ke)以(yi)干冰過夜運輸(shu)寄送(song)即可(ke)；

②石蠟包埋

盡可(ke)能取(qu)活(huo)性(xing)較好的(de)組織(zhi)樣本并隨即投入固定液。材料應(ying)該(gai)小(xiao)而薄，一般厚度大于3mm，大小(xiao)不(bu)超過6.5×6.5mm2；

注：蠟(la)(la)塊(kuai)存放(fang)于室溫或 4~8℃，石蠟(la)(la)包埋(mai)樣本需要冷(leng)凍(dong)冰袋送樣（2-3個(ge)即可），無需干冰，順豐寄(ji)送；蠟(la)(la)塊(kuai)制作流(liu)程，要求脫水充(chong)分(fen)、浸蠟(la)(la)充(chong)分(fen)，切片(pian)可連續(xu)切片(pian)成片(pian)、無裂痕(hen)和空腔（組織本身(shen)自帶(dai)除外），樣本切片(pian)過程中不(bu)會與(yu)外部包埋(mai)的(de)蠟(la)(la)分(fen)離。

（2）選片

無論是新鮮冷凍組(zu)織(zhi)樣本還是FFPE樣本，都需要通過普(pu)通HE染色(se)，選擇組(zu)織(zhi)形態的完整(zheng)性較好(hao)的切片進行后續(xu)實驗。

（圖片來自10x）

（3）正(zheng)式(shi)實驗

①組織透化

10×Visium組織(zhi)預(yu)透化（Tissue Optimization，也叫組織(zhi)優化）：連續(xu)切片子(zi)，在預(yu)透化玻片上進行組織(zhi)預(yu)透化實(shi)驗，其目的是摸(mo)索最(zui)佳的mRNA釋放時間（透化時間），以便達到最(zui)好的實(shi)驗效果。具體過程如下：

選擇目標區域附近的組織切片，在普通玻片上進行固定和染色；采用不同的時間梯度，進行透化處理，6個透化梯度時間樣本（官方推薦3/6/12/18/24/30 min），1個陰性對照，1個陽性對照；用帶有熒光的核苷酸進行反轉錄合成cDNA。酶處理移除樣本組織，然后對帶有熒光標記的cDNA進行成像；對比H&E和熒光成像，選擇熒(ying)光信(xin)號較強(qiang)、mRNA彌散(san)較小(xiao)、內部組織結構清晰的(de)時間點，作為正式實驗(yan)透化(hua)時間點。

華(hua)大Stereo-seq預透化：

對新(xin)鮮或冷(leng)凍組織進行(xing)(xing) OCT 包埋，連續切取厚(hou)度(du)為(wei) 10μm 的(de)切片(pian)。建議制(zhi)備至少 4張用于(yu)透(tou)化(hua)測(ce)試的(de)切片(pian)，并額(e)外保留2張用于(yu)H&E染色(se)及質檢。具體實(shi)驗(yan)過程根據華大 STOmics Stereo-seq 透(tou)化(hua)試劑套裝進行(xing)(xing)預透(tou)化(hua)實(shi)驗(yan)，最終選擇在組織移除干凈且保持相同成(cheng)像條件（包括亮度(du)和曝光等條件）的(de)情況下，以(yi)組織形(xing)態(tai)完整(zheng)、熒(ying)光值較(jiao)強且無(wu)彌(mi)散為(wei)最佳(jia)透(tou)化(hua)時間的(de)判斷標準(zhun)。

②cDNA文庫構建

使用組織(zhi)(zhi)表達芯片(pian)進(jin)行(xing)空間轉(zhuan)錄組文庫制備。按照最(zui)佳(jia)組織(zhi)(zhi)透(tou)化時間進(jin)行(xing)組織(zhi)(zhi)透(tou)化，釋(shi)放組織(zhi)(zhi)mRNA與芯片(pian)上(shang)的捕獲序(xu)列結合，逆轉(zhuan)錄合成cDNA片(pian)段(duan)并標記(ji)空間位置，PCR擴增合成cDNA二(er)鏈(lian)(lian)。通過堿性(xing)環境(jing)使cDNA變性(xing)將cDNA二(er)鏈(lian)(lian)釋(shi)放到液(ye)體游離環境(jing)，以cDNA二(er)鏈(lian)(lian)為模板進(jin)一(yi)步擴增合成大量cDNA。將cDNA酶切打斷成200-300bp的片(pian)段(duan)，加(jia)上(shang)P5接(jie)頭(tou)、i5樣(yang)本索(suo)引(yin)、read 2、i7樣(yang)本索(suo)引(yin)和(he)P7接(jie)頭(tou)構建(jian)標準測序(xu)文庫。

（4）上機測(ce)序(xu)

使用Illumina 或(huo)華大(da)T7測序平臺進行上機測序。

（5）數(shu)據分析

利用(yong)10×Space ranger 數據或Stereo-seq Analysis Workflow軟(ruan)件(jian)對測序(xu)獲(huo)得的原始數據進(jin)行初步分析(xi)(xi)，組織染色(se)照片和芯片序(xu)列(lie)號一同輸入軟(ruan)件(jian)進(jin)行數據質控(kong)和序(xu)列(lie)比對，從(cong)而(er)獲(huo)取高質量的測序(xu)數據、Spot/Bin在(zai)組織中的空(kong)間(jian)(jian)分布位置以(yi)及(ji)基因(yin)在(zai)各個Spot/Bin 的表(biao)達(da)量情況。隨后利用(yong)這(zhe)些數據開(kai)展分群、亞群特征基因(yin)分析(xi)(xi)、Spot/Bin 注(zhu)釋(shi)、空(kong)間(jian)(jian)擬(ni)時分析(xi)(xi)、空(kong)間(jian)(jian)通訊分析(xi)(xi)等深入研究。

二、空間轉錄組測序樣本質檢

空(kong)間(jian)轉錄(lu)組測(ce)序樣本質檢(jian)中(zhong)，RNA 完(wan)整性(xing)是核(he)心指標，直接(jie)影響(xiang)基因(yin)表達數據的(de)(de)可靠性(xing)及檢(jian)測(ce)基因(yin)的(de)(de)完(wan)整性(xing)。其評(ping)估常通過 RNA 完(wan)整性(xing)數值(zhi)（RIN）衡量，數值(zhi)越(yue)高，代表與空(kong)間(jian)轉錄(lu)組探針結合(he)的(de)(de)幾率(lv)就(jiu)越(yue)高。其次新(xin)鮮(xian)冷凍OCT包(bao)埋(mai)（FF）（RIN≥7） vs石蠟(la)包(bao)埋(mai) FFPE（DV200≥30%）組織的(de)(de)質控閾值(zhi)不(bu)同。

1、新鮮冷凍(dong)OCT包埋組織(zhi)

新(xin)鮮(xian)冷(leng)凍組織的 RNA 質量(liang)主要以 RIN 值(zhi)衡(heng)量(liang)，該值(zhi)通過 Agilent 2100 生物分析儀(yi)基于電泳圖對(dui)真(zhen)核總 RNA 質量(liang)分類，范圍 1-10，1 代(dai)表(biao)(biao)降解嚴重、10 代(dai)表(biao)(biao)完(wan)整性高(gao)。

注：通(tong)常切(qie)取 10 片組織切(qie)片進行 RNA 抽提(ti)和質檢(jian)，建議使用 RIN 值(zhi)＞7 的樣本開展空(kong)間實驗。

（不(bu)同樣本(ben)的rin值檢測圖片，來自安(an)捷倫官方）

2、FFPE組織樣本

石(shi)蠟包埋（FFPE）組織是生物學尤(you)其是醫學領域常(chang)見(jian)的(de)組織保存形式，但該方(fang)式會導(dao)致(zhi)DNA/RNA 降解(jie)，mRNA的(de)polyA尾(wei)斷(duan)裂，故采用DV200 進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)，DV200指超過 200 個核苷酸RNA片段百分比(bi)，其值越高，RNA完整度及(ji)與空間探針的(de)結合概率越高。

一般切取(qu)5-10片FFPE組(zu)織切片進(jin)(jin)行(xing)RNA抽提并進(jin)(jin)行(xing)DV200檢測，建議使(shi)用DV200≥30%的FFPE樣本進(jin)(jin)行(xing)Visium實驗(yan)。

三、避(bi)坑指南

空間轉錄組(zu)(zu)各種不(bu)好(hao)處理的樣品組(zu)(zu)織(zhi)如骨組(zu)(zu)織(zhi)（硬(ying)骨、軟(ruan)骨）、脂肪、血管(guan)、肌肉(rou)、皮膚專用處理方(fang)案。

1、骨(gu)組織

硬(ying)骨(gu)(gu)組織堅硬(ying)、需脫鈣(gai)、透(tou)(tou)化(hua)難。軟(ruan)骨(gu)(gu)組織高基質密度(du)阻礙透(tou)(tou)化(hua)/RNA釋放，因此硬(ying)骨(gu)(gu)和軟(ruan)骨(gu)(gu)務必進行(xing)溫(wen)和脫鈣(gai)（推(tui)薦EDTA，避免強(qiang)酸），嚴格監(jian)控時(shi)間(jian)防(fang)止過脫鈣(gai)。顯(xian)著延長透(tou)(tou)化(hua)時(shi)間(jian)或使用增(zeng)強(qiang)型透(tou)(tou)化(hua)試劑，確保RNA有效釋放。處理全程保持低(di)溫(wen)，保護(hu)RNA。

2、脂肪組織

脂肪組織(zhi)結構(gou)特(te)殊，含有(you)較(jiao)多(duo)的油脂成(cheng)分，無論(lun)是(shi)冰凍切片(pian)還是(shi)石蠟包埋切片(pian)都(dou)較(jiao)其他(ta)(ta)組織(zhi)困難。小鼠(shu)/人優先FFPE或FF，其他(ta)(ta)選 FF；FFPE制備需用固(gu)定液，紗布蓋防漂(piao)浮(fu)，嚴控無水乙(yi)醇、二甲(jia)苯脫水時間；對于FF樣本(ben)，相比(bi)于其他(ta)(ta)組織(zhi)，脂肪組織(zhi)通常需要更厚的切片(pian)，推薦(jian)10-20μm。

3、血管(guan)組織

血(xue)管(guan)(guan)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)由(you)內(nei)皮細(xi)胞、平滑肌、結(jie)締組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)及彈(dan)(dan)性(xing)纖維構成，管(guan)(guan)壁(bi)分層明顯（內(nei)膜(mo)、中(zhong)膜(mo)、外(wai)膜(mo)），質地較(jiao)脆(cui)且易收縮，血(xue)管(guan)(guan)腔易塌(ta)陷(xian)，無論是(shi)冰凍(dong)切(qie)片(pian)還是(shi)石蠟包(bao)埋(mai)切(qie)片(pian)都較(jiao)其他(ta)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)困難(nan)。小鼠 / 人血(xue)管(guan)(guan)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)優(you)先(xian) FFPE ，因為其采(cai)用(yong)的(de)OCT包(bao)埋(mai)劑灌(guan)注(zhu)難(nan)度較(jiao)大。血(xue)管(guan)(guan) FFPE 樣(yang)本因管(guan)(guan)壁(bi)含(han)較(jiao)多彈(dan)(dan)性(xing)纖維，易出現切(qie)片(pian)碎裂，建議采(cai)用(yong)防脫載玻(bo)片(pian)，因血(xue)管(guan)(guan)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)切(qie)片(pian)在水浴(yu)中(zhong)易發生(sheng)腔室(shi)變形(xing)，故(gu)可(ke)降低展片(pian)溫度并縮短展片(pian)時間。

4、肌肉組織

肌(ji)(ji)(ji)肉組(zu)織(zhi)(zhi)由肌(ji)(ji)(ji)纖(xian)維與(yu)結(jie)(jie)締(di)組(zu)織(zhi)(zhi)構成，肌(ji)(ji)(ji)纖(xian)維排列有(you)序且韌性(xing)較強(qiang)，肌(ji)(ji)(ji)纖(xian)維與(yu)結(jie)(jie)締(di)組(zu)織(zhi)(zhi)結(jie)(jie)合緊密程度不一，切(qie)片時易(yi)出現肌(ji)(ji)(ji)纖(xian)維斷裂、切(qie)片褶皺、層次(ci)分(fen)離等問題。小鼠/人肌(ji)(ji)(ji)肉組(zu)織(zhi)(zhi)優先采(cai)用FF或FFPE組(zu)織(zhi)(zhi)形(xing)式，優先選(xuan)擇(ze)FF，OCT作為冷凍包(bao)埋(mai)劑，能在低溫下快(kuai)速固定(ding)肌(ji)(ji)(ji)纖(xian)維排列，減少冰晶對(dui)肌(ji)(ji)(ji)纖(xian)維的損(sun)傷，且無需高溫處理，可最(zui)大程度保留(liu) RNA 的分(fen)子活性(xing)，更適配(pei)空間轉(zhuan)錄組(zu)對(dui)基因(yin)表達原位(wei)信息的精準捕捉。

5、皮膚組(zu)織

皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)(fu)(fu)由表(biao)(biao)皮(pi)(pi)(pi)和真皮(pi)(pi)(pi)構成，與皮(pi)(pi)(pi)下(xia)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)相連，由于皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)(fu)(fu)層(ceng)次(ci)豐(feng)富(fu)，結構復雜，質(zhi)地堅韌，各層(ceng)細胞間的致密度不(bu)同，在(zai)切(qie)片(pian)中(zhong)常出現皺(zhou)網狀層(ceng)松(song)散(san)、淺層(ceng)出現碎(sui)裂(lie)等。建議(yi)人和小鼠(shu)物(wu)種采用FFPE組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)形式。取材時切(qie)下(xia)皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)(fu)(fu)愈(yu)早固(gu)定愈(yu)好，防(fang)止時間過長引起組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)收縮變(bian)形或發生自溶。包埋(mai)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)包埋(mai)時表(biao)(biao)皮(pi)(pi)(pi)朝上(shang)，皮(pi)(pi)(pi)下(xia)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)朝下(xia)，切(qie)片(pian)時依次(ci)從皮(pi)(pi)(pi)下(xia)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)、真皮(pi)(pi)(pi)層(ceng)、表(biao)(biao)皮(pi)(pi)(pi)層(ceng)，最后切(qie)角質(zhi)層(ceng)。皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)(fu)(fu)FFPE樣本高脂質(zhi)含量(liang)，粘性(xing)較低(di)導(dao)致脫(tuo)片(pian)，建議(yi)采用防(fang)脫(tuo)載玻片(pian)，因(yin)皮(pi)(pi)(pi)膚(fu)(fu)(fu)組(zu)織(zhi)(zhi)(zhi)切(qie)片(pian)在(zai)水浴中(zhong)能迅(xun)速(su)膨脹(zhang)，故可降低(di)展片(pian)溫度。

四、總 結

空間轉(zhuan)錄組實驗成敗，樣(yang)本處理(li)是核心(xin)。從科(ke)學設計（合理(li)選樣(yang)、充足(zu)生物重復）、全流程規范操作(zuo)（包(bao)埋(mai)、透化等），到嚴格質控（FF的RIN≥7、FFPE的 DV200≥30%），再(zai)到特(te)殊組織專(zhuan)屬方案，每步精細(xi)把控，方能保障數據可靠，助力科(ke)研工作(zuo)者更精準地(di)解碼生命的空間奧秘。