2017-02-23
以PacBio公司(si)的(de)SMRT單(dan)分(fen)子實(shi)時測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術（Single molecule real-time sequencing）為(wei)代表(biao)的(de)三代測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術，通過(guo)其獨有的(de)環(huan)形一(yi)致性測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)模式（Circular-consensus sequence，CCS），極(ji)大提高單(dan)堿基測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)準確(que)率，遠超Illumina等二代測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術。與傳統(tong)轉錄(lu)組(zu)(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)項目相(xiang)比(bi)，利用PacBio平臺的(de)全長(chang)轉錄(lu)組(zu)(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術可以直(zhi)接(jie)獲得mRNA的(de)全長(chang)，保證了(le)mRNA序(xu)(xu)(xu)(xu)列的(de)精確(que)性。近(jin)期我們(men)將陸(lu)續推出全長(chang)轉錄(lu)組(zu)(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)技(ji)(ji)術相(xiang)關文章，供討論和交流。本期將為(wei)大家介(jie)紹全長(chang)轉錄(lu)組(zu)(zu)測(ce)(ce)序(xu)(xu)(xu)(xu)的(de)技(ji)(ji)術原理(li)和實(shi)驗流程。
技術原理
PacBio SMRT技術應用(yong)了邊(bian)合(he)(he)成邊(bian)測序的思想，并以(yi)SMRT芯(xin)片(pian)為測序載體。芯(xin)片(pian)上(shang)有很(hen)多零模(mo)(mo)(mo)波(bo)(bo)導孔（ZMW，zero-mode waveguides），每個(ge)孔底(di)部(bu)均固定(ding)著(zhu)DNA聚(ju)合(he)(he)酶。在(zai)文(wen)庫構建(jian)時將雙鏈(lian)(lian)模(mo)(mo)(mo)板(ban)DNA兩(liang)端加上(shang)Adapter，形(xing)成一(yi)個(ge)環狀(zhuang)單鏈(lian)(lian)DNA，每個(ge)環化(hua)后的DNA會(hui)(hui)落在(zai)一(yi)個(ge)零模(mo)(mo)(mo)波(bo)(bo)導孔中(zhong)，與底(di)部(bu)的DNA聚(ju)合(he)(he)酶結(jie)合(he)(he)。用(yong)4種(zhong)顏色的熒光標記4 種(zhong)堿基（即是dNTP）。在(zai)堿基配(pei)對階段(duan)，不同(tong)堿基的加入，會(hui)(hui)發出(chu)不同(tong)光，根據光的波(bo)(bo)長與峰值可判斷進入的堿基類型。而由于(yu)模(mo)(mo)(mo)板(ban)DNA是環狀(zhuang)，DNA聚(ju)合(he)(he)酶會(hui)(hui)一(yi)直圍繞模(mo)(mo)(mo)板(ban)DNA一(yi)圈(quan)一(yi)圈(quan)合(he)(he)成配(pei)對的DNA鏈(lian)(lian)。
實驗流程
將(jiang)提取的總RNA進行(xing)反轉(zhuan)錄，合成(cheng)cDNA并(bing)(bing)加接頭序列；根據片段(duan)大小將(jiang)cDNA進行(xing)分割；將(jiang)cDNA進行(xing)環(huan)化處理，并(bing)(bing)上機(ji)測(ce)序。詳(xiang)細流程請(qing)見下圖：
下一期，我們將針對全長轉錄組測(ce)序的分(fen)析流程進(jin)行闡(chan)述，敬請期待。
