2025-09-07
在(zai)轉錄組(zu)數據分(fen)(fen)析中，我們常(chang)(chang)常(chang)(chang)關注哪些基因在(zai)兩組(zu)樣(yang)本（如對(dui)照組(zu) vs 處理組(zu)）之(zhi)間存在(zai)表達差異。除了常(chang)(chang)規的(de)(de)(de)差異基因篩選和功能富集(ji)(ji)(ji)分(fen)(fen)析之(zhi)外，基因集(ji)(ji)(ji)富集(ji)(ji)(ji)分(fen)(fen)析（GSEA） 正逐漸成為深入挖(wa)掘生物學(xue)機制的(de)(de)(de)重要工(gong)具。接下來，小派將(jiang)帶(dai)你系(xi)統(tong)理解(jie)GSEA的(de)(de)(de)分(fen)(fen)析邏輯、結果解(jie)讀(du)方(fang)法及其實際應(ying)用。
一(yi)、什么是GSEA？
Gene Set Enrichment Analysis (GSEA，基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)集(ji)(ji)富(fu)(fu)集(ji)(ji)分析(xi))用來評估一個預先定(ding)義(yi)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)集(ji)(ji)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)在與表(biao)(biao)(biao)型(xing)相關度排(pai)(pai)(pai)序(xu)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)(biao)(biao)中(zhong)的(de)(de)(de)分布趨(qu)勢(shi)，從而判斷其(qi)對(dui)表(biao)(biao)(biao)型(xing)的(de)(de)(de)貢獻。其(qi)輸(shu)入(ru)數據包含兩部分，一是(shi)已知功能(neng)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)集(ji)(ji) (KEGG通(tong)路或GO 條(tiao)目或者(zhe)其(qi)他基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)集(ji)(ji))，一是(shi)表(biao)(biao)(biao)達矩陣 (也可以是(shi)排(pai)(pai)(pai)序(xu)好的(de)(de)(de)列表(biao)(biao)(biao)，例如(ru)根據log2FC排(pai)(pai)(pai)序(xu)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)列表(biao)(biao)(biao))，軟件分析(xi)時會對(dui)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)根據其(qi)與表(biao)(biao)(biao)型(xing)的(de)(de)(de)關聯度(可以理解為表(biao)(biao)(biao)達值的(de)(de)(de)變化(hua))從大到小排(pai)(pai)(pai)序(xu)，然后判斷基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)集(ji)(ji)內每條(tiao)注釋下的(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)是(shi)否富(fu)(fu)集(ji)(ji)于排(pai)(pai)(pai)序(xu)表(biao)(biao)(biao)的(de)(de)(de)上部或下部，從而判斷此基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)集(ji)(ji)內基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)協同變化(hua)對(dui)表(biao)(biao)(biao)型(xing)變化(hua)的(de)(de)(de)影響。
與常規富集分析不同，GSEA不依賴于“差異基因”的篩選閾值（如log2FC和p.val），而是利用全部基因的表達變化排序信息，檢測哪些基因集在不同組別比較中整體呈現上調(diao)或下調(diao)趨勢。
二．GSEA分析結果怎(zen)么(me)看？
（以云平臺GSEA分析結果為例）
1.GO/KEGG分(fen)析部分(fen)--下載全部GSEA結果表格
每個比較組(zu)中(zhong)包含兩個結果表(biao)格，在(zai)(zai)(zai)GO/KEGG-GSEA分(fen)(fen)析(xi)部分(fen)(fen)下(xia)載查看結果。以WW_vs_TT組(zu)為(wei)例，WW_vs_TT_KEGG_GSEA_enrichment_TT.xls文(wen)件中(zhong)，為(wei)在(zai)(zai)(zai)TT組(zu)（處理組(zu)）中(zhong)上調(diao)的(de)通路結果（包含顯(xian)著及非顯(xian)著通路），在(zai)(zai)(zai)WW文(wen)件中(zhong)，則是在(zai)(zai)(zai)WW組(zu)（對照組(zu)）上調(diao)（即在(zai)(zai)(zai)處理組(zu)中(zhong)下(xia)調(diao)）的(de)通路結果。
下方為GSEA_enrichment表格示例
ID&Description：基因集的名稱(cheng)（GO term或KEGG pathway名稱(cheng)）；
Size：通路(lu)/條目下包含的(de)基因數(shu)目（經過條件篩選后(hou)的(de)值）；
ES：富集得分(fen)（enrichment score）；
NES：ES的標準化值（normalized enrichment score），同時考慮基因集的個數及基因數目，NES的值代表該基因集中的基因在整體基因排序列表中的富集程度。簡(jian)單(dan)理解NES為正值基因(yin)集上(shang)調，負值基因(yin)集下調；
NOM p-val：P-value，針(zhen)對ES的(de)排(pai)列檢驗，表示(shi)基因集富(fu)集的(de)顯著性；
FWER p-val：用FWER法（Bonferonni校正）校正后的(de)P值；
FDR q-val：FDR法校(xiao)正的p值；
RANK AT MAX：當ES值達到最(zui)大時對應的(de)(de)那(nei)個基(ji)因在排序(xu)好(hao)的(de)(de)基(ji)因列表中(zhong)所處的(de)(de)位置；
LEADING：核心基因集，對ES貢獻最大的基因成(cheng)員(yuan)；該處有3個統計值：
tags：核心基(ji)因集占該基(ji)因集中基(ji)因總數的(de)百(bai)分比(bi)；
list：核心(xin)基(ji)因(yin)占所(suo)有基(ji)因(yin)的(de)百分(fen)比；
signal：將(jiang)前兩項統(tong)計(ji)數據(ju)合在一起(qi)計(ji)算出的富(fu)集信號強度；
CORE ENRICHMENT：該(gai)通路下的核心(xin)基因列表。
2.GO/KEGG-GSEA富集(ji)分析(xi)圖(tu)部分-查看每個條目(mu)/通路富集(ji)分析(xi)圖(tu)片(pian)
每(mei)個條目或者通(tong)路具體的GSEA富集圖(tu)（重要）在GO/KEGG-GSEA富集分析圖(tu)部分查看。
GSEA富集(ji)圖共包含三部分(fen)：
第一部分(fen)是排序(xu)后所(suo)有基(ji)因(yin)rank值(zhi)的(de)(de)分(fen)布，熱圖紅色部分(fen)對應的(de)(de)基(ji)因(yin)在TT組(zu)中(zhong)高(gao)表達(da)，藍色部分(fen)對應的(de)(de)基(ji)因(yin)在WW組(zu)中(zhong)高(gao)表達(da)；
第(di)二部(bu)分用線(xian)條標(biao)記了(le)基(ji)(ji)因(yin)(yin)集合中(zhong)成(cheng)員出現在(zai)基(ji)(ji)因(yin)(yin)排(pai)(pai)序(xu)列表中(zhong)的位(wei)置，黑線(xian)代表排(pai)(pai)序(xu)基(ji)(ji)因(yin)(yin)表中(zhong)的基(ji)(ji)因(yin)(yin)存在(zai)于(yu)當(dang)前分析(xi)的功能注釋(shi)基(ji)(ji)因(yin)(yin)集，每個黑線(xian)代表該通(tong)路中(zhong)的一個基(ji)(ji)因(yin)(yin)；第(di)三部(bu)分，Enrichment score折線(xian)圖(tu)，：顯示了(le)當(dang)分析(xi)沿著排(pai)(pai)名列表按排(pai)(pai)序(xu)計算(suan)時，ES值在(zai)計算(suan)到(dao)每個位(wei)置時的展示。最高峰處(chu)的得(de)分 (垂直距離0.0最遠)便是基(ji)(ji)因(yin)(yin)集的ES值。
在上圖中，我們一般關注ES值以及NES值，p-value值以及adjust-P值，NES為(wei)正值代表(biao)基因集(ji)在處(chu)理組(zu)(zu)上調，負值代表(biao)基因集(ji)在處(chu)理組(zu)(zu)下調（也就是在對(dui)照組(zu)(zu)上調），一(yi)般認為(wei)|NES|>1，NOM p-val<0.05，FDR q-val<0.25的通(tong)(tong)路是(shi)顯著富集(ji)的。在(zai)右側分析設置部分可選擇不同(tong)比(bi)較組以及關(guan)注通(tong)(tong)路重(zhong)新(xin)分析運(yun)行。
除了(le)上(shang)述圖片，每一個通路(lu)（條目(mu)）包含一個表(biao)格文件，在表(biao)格中主要關注哪(na)些(xie)基因是核心(xin)基因，也就(jiu)是對富集信(xin)號貢(gong)獻最大(da)的基因，后續(xu)可以挑(tiao)選核心(xin)基因進行進一步篩選、驗證(zheng)。
SYMBOL/Name：基因名；
RANK IN GENE LIST：表示在排序好的基因集中所處的位置；
RANK METRIC SCORE：表示基因排序評分
RUNNING ES：表示分析過(guo)程(cheng)中動態的ES值；
CORE ENRICHMENT：是(shi)對ES值有主(zhu)要貢獻的(de)基(ji)因(yin)，即Leading edge subset（核(he)(he)心基(ji)因(yin)）,Yes代表核(he)(he)心基(ji)因(yin)，No代表非核(he)(he)心基(ji)因(yin)。
3.GSEA-多(duo)通路(lu)富集分析圖
除了單個通路(lu)的GSEA富(fu)集(ji)分(fen)析(xi)圖之外(wai)，在高級繪圖部分(fen)還有GSEA-多通路(lu)富(fu)集(ji)分(fen)析(xi)圖，不同(tong)顏色(se)代表不同(tong)通路(lu)，可以在右(you)側分(fen)析(xi)設置部分(fen)切換GO或KEGG，自定義展示關注通路(lu)（最(zui)多5條，檢索時通路(lu)名需大寫）。
三、GSEA的(de)應用場景
1.捕捉微弱但一致的表達變化；
不需(xu)要設(she)置差異基因(yin)閾(yu)值(zhi)，避免遺漏雖(sui)未達到差異閾(yu)值(zhi)但(dan)生物學一(yi)致性高的基因(yin)集。
2.發現通路水平的調(diao)控機(ji)制(zhi)；
尤其(qi)適(shi)合癌(ai)癥、發(fa)育、免疫應答等(deng)涉及多基因協同調控的(de)研(yan)究場景(jing)。
3.輔助表型分型與生物(wu)(wu)標志物(wu)(wu)挖掘；
通過對通路活性(xing)進(jin)行(xing)聚類(lei)，可識別(bie)樣本亞型或發現潛在治療靶點(dian)。
派森諾(nuo)項目(mu)文章應用
GSEA富集(ji)分(fen)析圖
（//doi.org/10.1016/j.cej.2025.165421）
GSEA分(fen)析表明在TSPCs組中肌肉骨骼(ge)運動相(xiang)關基因(yin)集(ji)和細(xi)胞粘附分(fen)子相(xiang)關基因(yin)集(ji)顯著富集(ji)，證實了TSPCs通過(guo)細(xi)胞間相(xiang)互(hu)作用在組織修復中的積極作用。
GSEA-多通路富集分(fen)析(xi)圖
（//doi.org/10.1186/s12864-022-09100-8）
GSEA多通(tong)路富集分析(xi)顯(xian)(xian)示，與斑點組相比，正(zheng)常組中某些通(tong)路的表(biao)達水(shui)平較(jiao)低，其(qi)中鈣信(xin)號(hao)轉(zhuan)導通(tong)路、神經(jing)活性配體(ti)(ti)-受體(ti)(ti)相互(hu)作用、黏著斑和(he)MAPK信(xin)號(hao)通(tong)路顯(xian)(xian)著降(jiang)低。
