2017-02-17
簡化(hua)基因(yin)組(zu)測(ce)(ce)(ce)序（Reduced-Representation Genome Sequencing, RRGS）是(shi)指利用(yong)(yong)生物信(xin)息學方(fang)法，設計(ji)分子(zi)標(biao)記(ji)開發(fa)方(fang)案，篩選(xuan)特異性長度片(pian)段，應用(yong)(yong)高通(tong)量測(ce)(ce)(ce)序技術(shu)獲得海量標(biao)簽序列來充(chong)分代表目(mu)標(biao)物種(zhong)全基因(yin)組(zu)信(xin)息的測(ce)(ce)(ce)序策略。簡言(yan)之，簡化(hua)基因(yin)組(zu)測(ce)(ce)(ce)序就是(shi)基因(yin)組(zu)重測(ce)(ce)(ce)序的簡化(hua)版，小(xiao)編(bian)稱(cheng)之為 “省(sheng)錢的重測(ce)(ce)(ce)序”。
目前，主(zhu)流(liu)的簡化(hua)基因組建庫方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)包括 RAD 法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)（Restriction site Associated DNA），2b-RAD 法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)、GBS 法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)（Genotyping-By-Sequencing）、ddRAD 法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)（double-digest RAD，由于該種(zhong)方(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)建庫的流(liu)程更加類(lei)似于 GBS 法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)，所(suo)以(yi)也被稱為 ddGBS 法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)）。今天，小編就(jiu)給大(da)家(jia)簡要地介(jie)紹(shao)一下(xia) GBS 分析的一般流(liu)程。
GBS分析(xi)流程的三個主要步驟：
1. 原始(shi)數據處理
原始數(shu)據(ju)通常包(bao)含各種類型的錯誤，如堿基(ji)錯配、低質量(liang)(liang)堿基(ji)、接頭污染。因(yin)此，在進行后續分(fen)析前(qian)，小編強烈(lie)建議(yi)對下機(ji)數(shu)據(ju)進行質量(liang)(liang)評估、接頭序(xu)列去(qu)除、低質量(liang)(liang)數(shu)據(ju)過濾。目前(qian)主(zhu)流的用于原始數(shu)據(ju)處理的軟件(jian)包(bao)括：Trimmomatic、PRINSFQ、FastqMcf、FASTX-Toolkit和AdapterRemove2等(deng)。
2. 比對到(dao)參考基因(yin)組
數據過濾后，對(dui)于(yu)有參(can)考(kao)基因(yin)組的(de)物種，我(wo)們可(ke)以(yi)將短(duan)讀長比(bi)對(dui)到(dao)參(can)考(kao)基因(yin)組，序列比(bi)對(dui)軟(ruan)(ruan)件包(bao)括（MAP、mrsFast、STAMPY、Bowtie2、BWA和(he)SOAP2等(deng)）。對(dui)于(yu)無參(can)考(kao)基因(yin)組的(de)物種，我(wo)們可(ke)以(yi)利用STACKS，UNEAK或者RApiD等(deng)軟(ruan)(ruan)件將測(ce)序得到(dao)的(de) reads 拼接成 mini-contigs。這些mini-contigs可(ke)用于(yu)短(duan)讀長序列比(bi)對(dui)和(he)基因(yin)分(fen)型(xing)。
3. 變異檢測(ce)
比對(dui)到(dao)參考基因組(zu)后，一般會生成BAM文件(jian)。然后就可以檢(jian)測個體或(huo)群體的變(bian)異（包括(kuo)SNPs和InDels）。用于變(bian)異檢(jian)測的軟件(jian)有SAMtools、GATK，SOAP，SNVer和GNUMAP等。
小結：
本(ben)文(wen)簡(jian)單介紹了GBS分析的一(yi)般流程，以(yi)及在(zai)每一(yi)個流程中需(xu)要用(yong)到的一(yi)些軟(ruan)件(jian)。本(ben)流程中選(xuan)擇的軟(ruan)件(jian)均(jun)為運算效率(lv)較高的一(yi)些軟(ruan)件(jian)，具體軟(ruan)件(jian)見(jian)表1。
表1 GBS 分析流程中使用的軟件
此外(wai)，小(xiao)編還想(xiang)給想(xiang)要做(zuo)(zuo) GBS或正在做(zuo)(zuo) GBS 的老師們一些建議：
(1) 測(ce)序數(shu)據(ju)量很重(zhong)要(yao)！很重(zhong)要(yao)！！很重(zhong)要(yao)！！！數(shu)據(ju)量 = 標簽數(shu)*測(ce)序深度(du)*讀長(chang)；
（數據量(liang)太少(shao)，樣品之(zhi)間測到的標簽會不在基(ji)因組的同一位置）
(2) 標(biao)簽數不是隨意定(ding)的(de)，酶切位點決定(ding)標(biao)簽數量(liang)，所以選擇一款合適的(de)酶很重(zhong)要(yao)；
(3) 實驗(yan)過(guo)程很關鍵，PCR 循(xun)環(huan)(huan)可能會引入大量的重復序列，所以在建庫過(guo)程中，一定要降(jiang)(jiang)低(di) PCR 循(xun)環(huan)(huan)數(shu)！降(jiang)(jiang)低(di)PCR 循(xun)環(huan)(huan)數(shu)！！降(jiang)(jiang)低(di)PCR 循(xun)環(huan)(huan)數(shu)！！！
（重復序列的(de)存在會影響變異(yi)的(de)檢測）
原文(wen)索引: DataKagale S , Koh C , Clarke WE. Analysis of Genotyping-by-Sequencing (GBS)[J]Methods in Molecular Biology, 2016
