越來越多(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)成果表(biao)明(ming)(ming)非編碼RNA（lncRNAs）和(he)(he)(he)(he)環狀RNA（circRNAs）參(can)與(yu)胚(pei)(pei)(pei)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)發育。但是鮮少有研(yan)究(jiu)(jiu)lncRNAs和(he)(he)(he)(he)circRNAs在(zai)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)自我更新(xin)和(he)(he)(he)(he)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)化中的(de)(de)(de)(de)(de)功(gong)能(neng)和(he)(he)(he)(he)機(ji)制。因此，本文通過高(gao)通量測(ce)序，研(yan)究(jiu)(jiu)mRNAs，lncRNAs和(he)(he)(he)(he)circRNAs在(zai)雄性(xing)(xing)和(he)(he)(he)(he)雌(ci)性(xing)(xing)小鼠胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達分(fen)析。在(zai)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中鑒(jian)定(ding)了(le)(le)18,573個(ge)新(xin)lncRNAs和(he)(he)(he)(he)18,822個(ge)circRNA，并通過RT-PCR手段驗(yan)證了(le)(le)這(zhe)些lncRNAs和(he)(he)(he)(he)circRNAs的(de)(de)(de)(de)(de)存(cun)在(zai)。結果表(biao)明(ming)(ming)雄性(xing)(xing)和(he)(he)(he)(he)雌(ci)性(xing)(xing)小鼠的(de)(de)(de)(de)(de)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)(bao)有著(zhu)相似的(de)(de)(de)(de)(de)GDNF（神經膠質(zhi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)源性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)神經營養因子(zi)）信號傳導機(ji)制。隨(sui)后發現8,115個(ge)mRNAs，3,996個(ge)lncRNAs和(he)(he)(he)(he)921個(ge)circRNAs表(biao)現有性(xing)(xing)別(bie)(bie)偏向(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達方式，這(zhe)可能(neng)和(he)(he)(he)(he)生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)(bao)獲得獨特性(xing)(xing)別(bie)(bie)屬性(xing)(xing)需(xu)要分(fen)化成配子(zi)有關系。基(ji)(ji)因本體論(lun)（GO）和(he)(he)(he)(he)KEGG通路富集(ji)分(fen)析揭(jie)示了(le)(le)這(zhe)些性(xing)(xing)別(bie)(bie)偏向(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)lncRNAs和(he)(he)(he)(he)circRNAs的(de)(de)(de)(de)(de)不同功(gong)能(neng)。之后利(li)用(yong)生(sheng)物信息構建了(le)(le)關聯表(biao)達網絡圖(tu)，包(bao)括編碼-非編碼的(de)(de)(de)(de)(de)共(gong)(gong)表(biao)達競(jing)爭內源性(xing)(xing)RNAs。共(gong)(gong)表(biao)達分(fen)析表(biao)明(ming)(ming)數百的(de)(de)(de)(de)(de)lncRNAs和(he)(he)(he)(he)老鼠的(de)(de)(de)(de)(de)胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)(xing)別(bie)(bie)差異有關，包(bao)括lncRNA Gm11851，lncRNA Gm12840，lncRNA 4930405022Rik，和(he)(he)(he)(he)lncRNAAtp 10d。ceRNA網絡圖(tu)推測(ce)lncRNA Meg3和(he)(he)(he)(he)circRNA Igf1r會競(jing)爭性(xing)(xing)結合miRNA-15a-5p，增加靶基(ji)(ji)因Inha，Acsl3，Kif21b和(he)(he)(he)(he)Igfbp2的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達。這(zhe)些發現為(wei)lncRNAs和(he)(he)(he)(he)circRNAs的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)提供了(le)(le)新(xin)視角，也為(wei)以后對胚(pei)(pei)(pei)胎(tai)生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)(bao)中lncRNAs和(he)(he)(he)(he)circRNAs的(de)(de)(de)(de)(de)調控機(ji)制的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)奠(dian)定(ding)了(le)(le)基(ji)(ji)礎。

實驗路線圖

結果

小鼠胚胎生殖細胞文庫的鏈特異性RNA測序和組裝

使用(yong)熒(ying)(ying)光活化細(xi)胞分(fen)(fen)選法(fa)分(fen)(fen)離SSCs和(he)FGSCs。（圖(tu)(tu)1A-1D）評估(gu)胚(pei)(pei)胎(tai)生(sheng)殖(zhi)細(xi)胞的(de)(de)方法(fa)如下(xia)：首先通過RT-PCR檢測(ce)SSCs和(he)FGSCs中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)Mvh，Dazl，Fragilis，Otc4，Stella和(he)Blimp1的(de)(de)基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)。結(jie)果表(biao)(biao)明(ming)細(xi)胞中(zhong)(zhong)(zhong)表(biao)(biao)達(da)Mvh，Dazl，Fragilis，Otc4，Stella和(he)Blimp1。然后(hou)，免疫熒(ying)(ying)光分(fen)(fen)析驗證(zheng)Mvh，Otc4和(he)Dazl的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)。隨后(hou)，基(ji)于前面的(de)(de)結(jie)果，檢測(ce)18個(ge)生(sheng)殖(zhi)細(xi)胞基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)，發(fa)現18個(ge)生(sheng)殖(zhi)細(xi)胞基(ji)因(yin)在SSCs和(he)FGSCs中(zhong)(zhong)(zhong)都有表(biao)(biao)達(da)。最后(hou)，結(jie)合EdU的(de)(de)熒(ying)(ying)光免疫分(fen)(fen)析證(zheng)明(ming)SSCs和(he)FGSCs擁有繁(fan)殖(zhi)能(neng)力，分(fen)(fen)離得到(dao)(dao)的(de)(de)SSCs和(he)FGSCs中(zhong)(zhong)(zhong)真正的(de)(de)胚(pei)(pei)胎(tai)生(sheng)殖(zhi)細(xi)胞占有相似的(de)(de)比(bi)例（>90%）（圖(tu)(tu)1E-1J）。通過Illumina（雙端）測(ce)序技術，分(fen)(fen)析兩種胚(pei)(pei)胎(tai)生(sheng)殖(zhi)細(xi)胞中(zhong)(zhong)(zhong)mRNAs和(he)非編碼RNAs的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)。SSC和(he)FGSC文庫分(fen)(fen)別產生(sheng)了(le)249,912,216和(he)216,924,516條raw reads，GC含量(liang)分(fen)(fen)別是53.5%和(he)50.7%。過濾之后(hou)，得到(dao)(dao)233,978,622（93.6%）和(he)246,157,442（94.0%）條clean reads，用(yong)以做(zuo)后(hou)續分(fen)(fen)析。SSC和(he)FGSC文庫比(bi)對上小鼠參考基(ji)因(yin)組（UCSC mm10）的(de)(de)比(bi)例分(fen)(fen)別是86.7%和(he)91.1%，利用(yong)Scrupture和(he)Cufflinks組裝了(le)58,364個(ge)轉錄本。

圖1 FGSCs和SSCs的分離和純化

SSCs和FGSCs中新lncRNA的鑒定

將(jiang)6個(ge)(ge)(ge)樣本(ben)(ben)的(de)(de)(de)數據在RefSeq，Ensembl，或(huo)者NoncodelncRNA數據庫(ku)中(zhong)(zhong)(zhong)搜索(suo)以確認新(xin)(xin)lncRNA。為(wei)了將(jiang)58,364個(ge)(ge)(ge)轉(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)中(zhong)(zhong)(zhong)lncRNA的(de)(de)(de)假陽性最小(xiao)(xiao)(xiao)化，使(shi)用(yong)(yong)嚴格(ge)的(de)(de)(de)過濾方法(fa)去掉沒有(you)(you)lncRNA所(suo)有(you)(you)特性的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)。去除長(chang)度(du)小(xiao)(xiao)(xiao)于200bp，只有(you)(you)一(yi)個(ge)(ge)(ge)外顯子，少(shao)于3次(ci)覆(fu)蓋率(lv)的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)，使(shi)用(yong)(yong)CPC和(he)(he)(he)(he)CNCI軟件對剩余的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)進(jin)行編碼(ma)潛能預測，鑒定出18,573個(ge)(ge)(ge)新(xin)(xin)lncRNAs和(he)(he)(he)(he)5803個(ge)(ge)(ge)已知(zhi)lncRNAs（圖(tu)2A）。新(xin)(xin)lncRNA的(de)(de)(de)平均長(chang)度(du)是(shi)1,427個(ge)(ge)(ge)核苷酸，和(he)(he)(he)(he)已知(zhi)lncRNAs長(chang)度(du)相似（圖(tu)2B）。lncRNAs和(he)(he)(he)(he)mRNAs的(de)(de)(de)開(kai)放閱讀框（ORF）的(de)(de)(de)平均大(da)(da)小(xiao)(xiao)(xiao)分(fen)別是(shi)86.24bp和(he)(he)(he)(he)394.84bp，表明mRNA的(de)(de)(de)ORFs要(yao)明顯長(chang)于lncRNA的(de)(de)(de)ORF。LncRNA不能編碼(ma)蛋(dan)白質因(yin)為(wei)缺少(shao)重要(yao)的(de)(de)(de)ORFs。在18,573個(ge)(ge)(ge)新(xin)(xin)lncRNAs中(zhong)(zhong)(zhong)，我們發現4300個(ge)(ge)(ge)新(xin)(xin)lncRNAs表達量FPKM值(zhi)>1，12,022個(ge)(ge)(ge)新(xin)(xin)lncRNAs表達量FPKM值(zhi)>0.5。隨機挑(tiao)選SSCs和(he)(he)(he)(he)FGSCs文庫(ku)中(zhong)(zhong)(zhong)鑒定的(de)(de)(de)6個(ge)(ge)(ge)新(xin)(xin)lncRNA轉(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)，通過RT-PCR驗證。圖(tu)2C中(zhong)(zhong)(zhong)，6個(ge)(ge)(ge)lncRNA轉(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)進(jin)行擴增(zeng)獲(huo)得預期(qi)大(da)(da)小(xiao)(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄(lu)(lu)本(ben)(ben)。另外用(yong)(yong)RT-PCR擴增(zeng)TCONS_00083536，通過RACE技(ji)術克(ke)隆基(ji)因(yin)序列(lie)，獲(huo)得了1163bp長(chang)度(du)的(de)(de)(de)序列(lie)。克(ke)隆得到(dao)的(de)(de)(de)序列(lie)能和(he)(he)(he)(he)RNA-seq數據庫(ku)完全匹配(pei)。qRT-PCR結(jie)(jie)果表明兩組(zu)樣本(ben)(ben)中(zhong)(zhong)(zhong)選擇(ze)的(de)(de)(de)lncRNAs的(de)(de)(de)表達模式和(he)(he)(he)(he)lncRNAs的(de)(de)(de)FPKM值(zhi)是(shi)一(yi)致的(de)(de)(de)，測序結(jie)(jie)果合qRT-PCR結(jie)(jie)果是(shi)相關的(de)(de)(de)（圖(tu)2D）。以上分(fen)析結(jie)(jie)果表明我們篩選lncRNA的(de)(de)(de)方法(fa)是(shi)嚴謹的(de)(de)(de)，大(da)(da)部分(fen)的(de)(de)(de)lncRNA是(shi)在體(ti)內真正表達的(de)(de)(de)。

圖2 新lncRNA的(de)鑒定和驗(yan)證

染色體定位和新lncRNA的分類

LncRNA和mRNA轉(zhuan)錄本(ben)分(fen)(fen)(fen)布在(zai)所(suo)有的(de)(de)(de)小鼠染(ran)色體(ti)上。分(fen)(fen)(fen)析(xi)結果表(biao)明(ming)新lncRNAs在(zai)所(suo)有染(ran)色體(ti)上廣泛分(fen)(fen)(fen)布，每(mei)條染(ran)色體(ti)上lncRNA的(de)(de)(de)表(biao)達比(bi)率要(yao)比(bi)mRNA的(de)(de)(de)表(biao)達比(bi)率高很多（圖3A）。這(zhe)些分(fen)(fen)(fen)析(xi)結果證明(ming)在(zai)雄性和雌性小鼠胚(pei)胎生殖細胞中lncRNAs基因(yin)的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄與mRNA基因(yin)的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄一致(zhi)性很好。依據lncRNA相對(dui)于最近的(de)(de)(de)蛋白編碼基因(yin)的(de)(de)(de)位置，將lncRNA分(fen)(fen)(fen)類：正向重合lncRNA，雙(shuang)向lncRNA，反向lncRNA和基因(yin)區間lncRNA。測序得(de)到的(de)(de)(de)新lncRNAs中，主要(yao)是基因(yin)間區lncRNAs ，不同類型的(de)(de)(de)lncRNAs在(zai)SSCs和FGSCs中數量是相似的(de)(de)(de)（圖3B）。

圖(tu)3 新lncRNA染色(se)體分布(bu)和分類

小鼠SSCs和FGSCs中相似的lncRNA分析與共有的GDNF信號傳導機制

前(qian)期的(de)(de)(de)(de)芯片(pian)數(shu)據(ju)表(biao)(biao)明(ming)(ming)SSCs和FGSCs中所有(you)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因表(biao)(biao)達都是相(xiang)(xiang)似的(de)(de)(de)(de)。高(gao)通量測序數(shu)據(ju)驗證了這(zhe)個(ge)結論。所有(you)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因表(biao)(biao)達模式分(fen)析(xi)表(biao)(biao)明(ming)(ming)在(zai)SSCs和FGSCs中有(you)些(xie)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)mRNA和lncRNA水平是有(you)相(xiang)(xiang)似的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)達模式（圖(tu)4A，4B）。對高(gao)度共表(biao)(biao)達的(de)(de)(de)(de)mRNAs和lncRNAs進行功能(neng)富集分(fen)析(xi)，發現主(zhu)要(yao)富集在(zai)細胞周(zhou)期，細胞增(zeng)殖(zhi)和細胞分(fen)裂相(xiang)(xiang)關的(de)(de)(de)(de)GO term上，意味著SSCs和FGSCs有(you)著相(xiang)(xiang)似的(de)(de)(de)(de)胚胎生殖(zhi)細胞維護(hu)機制，這(zhe)和之前(qian)的(de)(de)(de)(de)芯片(pian)數(shu)據(ju)分(fen)析(xi)結果一致。

GDNF是(shi)促進(jin)SSC進(jin)行自我(wo)更(geng)(geng)新的(de)(de)第(di)一優先(xian)級的(de)(de)外(wai)在因(yin)素，主要通(tong)(tong)過PI3K-Akt，Ras/ERK1/2和(he)SFK通(tong)(tong)路促進(jin)SSC自我(wo)更(geng)(geng)新。為了驗證(zheng)FGSCs是(shi)否和(he)SSCs有(you)(you)(you)相同的(de)(de)GDNF信號(hao)機制，在7天(tian)中(zhong)去除培養基里面的(de)(de)GDNF，發現結(jie)果(guo)和(he)SSCs類似。去除GDNF一個星期(qi)導致細胞(bao)數量嚴重減少（1.0× 105減少到0.4× 105）（圖(tu)4C-4E）。隨后，將(jiang)GFRα1（GDNF家族(zu)受體alpha 1）通(tong)(tong)過免(mian)疫熒(ying)光染色觀察其在FGSCs表(biao)(biao)面的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)（圖(tu)4F）。之前有(you)(you)(you)研究表(biao)(biao)明(ming)對GDNF響應最明(ming)顯(xian)的(de)(de)基因(yin)有(you)(you)(you)Bc16b，Lhx1，Etv5和(he)Egr3。基于以上信息，進(jin)一步發現去除GDNF一星期(qi)引起FGSCs中(zhong)這(zhe)些(xie)也和(he)自我(wo)更(geng)(geng)新相關的(de)(de)基因(yin)表(biao)(biao)達(da)水平減少。這(zhe)些(xie)結(jie)果(guo)說明(ming)FGSCs和(he)SSCs有(you)(you)(you)著類似的(de)(de)GDNF信號(hao)傳(chuan)導機制。

圖4 SSCs和(he)FGSCs中mRNA和(he)lncRNA的(de)表達分析(xi)及共有(you)的(de)自我更新(xin)機制研究

轉錄組學分析揭示大量lncRNAs的表達有性別偏向性

鏈(lian)特異(yi)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)高(gao)通量測序提供精準的(de)(de)(de)基因表(biao)(biao)(biao)達分析，這有(you)利于(yu)挑選在(zai)雄性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)和雌(ci)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)胚胎生殖細胞中有(you)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)別(bie)偏(pian)(pian)(pian)向(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達的(de)(de)(de)基因，以(yi)做(zuo)特殊性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)別(bie)表(biao)(biao)(biao)達分析。通過(guo)lncRNA和mRNA分析，發(fa)現(xian)有(you)8,115個(ge)(ge)mRNAs和3,996個(ge)(ge)lncRNAs（包(bao)含(han)3,695個(ge)(ge)新(xin)lncRNA）表(biao)(biao)(biao)現(xian)出性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)別(bie)偏(pian)(pian)(pian)向(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達。其(qi)中，1,500個(ge)(ge)lncRNAs（包(bao)含(han)1,364個(ge)(ge)新(xin)lncRNAs）和4,221個(ge)(ge)mRNAs表(biao)(biao)(biao)現(xian)出雄性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)偏(pian)(pian)(pian)向(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達，2,496個(ge)(ge)lncRNAs（包(bao)含(han)2,331個(ge)(ge)新(xin)lncRNAs）和3,894個(ge)(ge)mRNA表(biao)(biao)(biao)現(xian)出雌(ci)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)偏(pian)(pian)(pian)向(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達（圖(tu)5A，5B）。雄性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)偏(pian)(pian)(pian)向(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達的(de)(de)(de)lncRNAs優勢(shi)比(bi)是1.22（雄性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)偏(pian)(pian)(pian)向(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達的(de)(de)(de)RNAs/非雄性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)偏(pian)(pian)(pian)向(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達的(de)(de)(de)RNAs），說明(ming)雄性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)偏(pian)(pian)(pian)向(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)lncRNAs在(zai)常(chang)染色體中富集。mRNA也(ye)表(biao)(biao)(biao)現(xian)出類似的(de)(de)(de)趨勢(shi)。SSC和FGSC比(bi)較發(fa)現(xian)雌(ci)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)偏(pian)(pian)(pian)向(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)lncRNAs和mRNAs在(zai)X染色體上顯著過(guo)表(biao)(biao)(biao)達。

圖5 轉錄(lu)組學分析性別偏(pian)向性表達(da)(da)的mRNAs（A）和(he)lncRNAs（B）的表達(da)(da)豐度

性別偏向性lncRNA的靶基因預測和功能分析

LncRNAs通(tong)常和(he)關(guan)聯的(de)(de)(de)mRNA同時轉錄組，可以調節(jie)重合或(huo)者(zhe)鄰近的(de)(de)(de)mRNAs的(de)(de)(de)轉錄組。所以，lncRNAs的(de)(de)(de)功(gong)能(neng)(neng)(neng)可以通(tong)過關(guan)聯的(de)(de)(de)mRNAs順式調控或(huo)者(zhe)反式調控作用反應出(chu)來(lai)。基(ji)(ji)于GO和(he)KEGG通(tong)路注釋(shi)靶基(ji)(ji)因，進(jin)行(xing)預測性別(bie)偏向(xiang)(xiang)性表(biao)達(da)的(de)(de)(de)lncRNA功(gong)能(neng)(neng)(neng)分析。在GO分析中(zhong)，lncRNAs最頻繁的(de)(de)(de)預測功(gong)能(neng)(neng)(neng)主要(yao)是和(he)行(xing)為，生物粘附(fu)，生物階段(duan)，和(he)生物調節(jie)有(you)關(guan)。功(gong)能(neng)(neng)(neng)聚(ju)類圖見(jian)圖6A。性別(bie)偏向(xiang)(xiang)表(biao)達(da)的(de)(de)(de)mRNAs和(he)lncRNAs富(fu)集在和(he)遺傳印記(ji)及遺傳印記(ji)的(de)(de)(de)調控有(you)關(guan)GO terms中(zhong)，這(zhe)表(biao)明遺傳印記(ji)的(de)(de)(de)差異可能(neng)(neng)(neng)調控SSCs和(he)FGSCs中(zhong)性別(bie)偏向(xiang)(xiang)基(ji)(ji)因的(de)(de)(de)表(biao)達(da)。

和(he)FGSC相比(bi)，SSC中總共有3,996個(ge)性別(bie)偏(pian)向表達的lncRNAs比(bi)對到204個(ge)KEGG通路(lu)（圖6B）。鑒(jian)定到的KEGG通路(lu)涉及糖(tang)代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)，蛋(dan)白(bai)代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)和(he)脂質(zhi)代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)通路(lu)，也包含類固醇合成(cheng)，甘(gan)油磷脂代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)，脂肪酸(suan)代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)，三羧酸(suan)循環，甘(gan)油酯代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)，維生素A代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)，戊糖(tang)和(he)葡萄(tao)糖(tang)醛酸(suan)轉換。SSCs和(he)FGSCs主要差異是胚胎細胞分化(hua)需要的性別(bie)特異屬性；SSCs分化(hua)成(cheng)精子(zi)，FGSCs分化(hua)成(cheng)卵(luan)母細胞。結果提議糖(tang)代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)，蛋(dan)白(bai)質(zhi)代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)和(he)脂質(zhi)代(dai)(dai)(dai)(dai)謝(xie)(xie)通路(lu)在細胞分化(hua)過(guo)程中占很(hen)大的比(bi)例，lncRNAs可(ke)能(neng)會通過(guo)這些(xie)信號通路(lu)影響(xiang)性被特異屬性。

圖6 性(xing)別偏向性(xing)lncRNAs的GO和KEGG通路分析

性別偏向性lncRNAs和mRNAs的共表達和功能預測

基(ji)于性(xing)別偏向(xiang)表達的(de)(de)(de)lncRNAs和(he)(he)mRNAs的(de)(de)(de)關聯分(fen)析，構建編碼-非編碼基(ji)因共表達網絡(luo)(luo)圖(tu)（CNC網絡(luo)(luo)圖(tu)）。選擇前10個意義重大的(de)(de)(de)性(xing)別偏向(xiang)表達的(de)(de)(de)編碼基(ji)因建立CNC網絡(luo)(luo)圖(tu)（圖(tu)7）。這些mRNAs涉及很多的(de)(de)(de)生(sheng)物過(guo)程(cheng)，包括生(sheng)殖(zhi)細(xi)胞分(fen)化(hua)的(de)(de)(de)增殖(zhi)，調控，遺(yi)傳(chuan)印記調控，性(xing)分(fen)化(hua)和(he)(he)性(xing)染色質。網絡(luo)(luo)圖(tu)中可以看出上調的(de)(de)(de)lncRNA Gm11851和(he)(he)參與(yu)遺(yi)傳(chuan)印記過(guo)程(cheng)的(de)(de)(de)Eed，Ndn和(he)(he)Peg3負相關，而lncRNA Gm12840是正相關。這說(shuo)明(ming)一個mRNA會和(he)(he)1-10個lncRNAs有關聯。

圖(tu)7 10個重(zhong)要(yao)的mRNAs和(he)關聯(lian)的lncRNAs的共表達網(wang)絡圖(tu)

胚胎生殖細胞中circRNAs的鑒定和功能分析

使用(yong)CIRI分(fen)析RNA-seq reads，分(fen)析胚胎生殖(zhi)細胞中circRNA。小鼠胚胎生殖(zhi)細胞中從5,334個(ge)(ge)來(lai)源基(ji)(ji)因(yin)中衍生出18,822個(ge)(ge)circRNA。其中大部分(fen)是外(wai)顯(xian)子circRNAs，只有(you)345個(ge)(ge)是內含子circRNAs。研(yan)究(jiu)發現9,812（52.13%）個(ge)(ge)circRNAs來(lai)源于(yu)同(tong)義鏈(lian)，9,010（47.87%）個(ge)(ge)circRNAs來(lai)源于(yu)反義鏈(lian)。之前(qian)的(de)(de)研(yan)究(jiu)表明circRNAs通(tong)常缺少來(lai)源基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)第一個(ge)(ge)和(he)最(zui)后一個(ge)(ge)外(wai)顯(xian)子，在本研(yan)究(jiu)中同(tong)樣發現類似的(de)(de)結論：18,822個(ge)(ge)circRNAs中有(you)18,803（99.9%）個(ge)(ge)circRNAs缺少對應來(lai)源基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)第一個(ge)(ge)或者(zhe)最(zui)后一個(ge)(ge)外(wai)顯(xian)子（圖8A）。

為了驗證circRNA的真(zhen)實性(xing)，隨機引(yin)物(wu)反(fan)轉(zhuan)cDNA，設計多(duo)對外(wai)向引(yin)物(wu)，放(fang)大中(zhong)cDNA鎖尾插接(jie)外(wai)顯子連接(jie)。通過RT-PCR，每對引(yin)物(wu)形成符合(he)期(qi)望大小的單一條帶，表(biao)示在(zai)SSC和(he)FGSC樣本(ben)中(zhong)存在(zai)環(huan)狀連接(jie)（圖(tu)8B）。如果用oligo（dT）引(yin)物(wu)反(fan)轉(zhuan)cDNA，得到的是(shi)只有poly-A的RNAs（圖(tu)8B），不(bu)能(neng)得到circRNA。這說明circRNA沒有poly-A尾。

將SSCs和(he)FGSCs中circRNA來(lai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的表達量和(he)其他(ta)基(ji)(ji)因(yin)(yin)比較，發現circRNA來(lai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的平均表達水(shui)平要顯著(zhu)高于非環狀(zhuang)轉錄本(ben)的基(ji)(ji)因(yin)(yin)（圖8C）。為了(le)預測胚(pei)(pei)胎生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)中這些circRNA來(lai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的功能，進行GO和(he)KEGG通路分析。結果(guo)表明circRNA來(lai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)在(zai)細(xi)胞(bao)(bao)中特異性表達。circRNA來(lai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)大多數(shu)的GO terms和(he)KEGG通路主要是和(he)胚(pei)(pei)胎生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)的自我更新和(he)分化有關，例如增殖，遺傳打(da)印，生(sheng)殖細(xi)胞(bao)(bao)維持，細(xi)胞(bao)(bao)分化等(deng)。

CircRNA的(de)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)分(fen)析表(biao)(biao)(biao)明(ming)921個circRNA表(biao)(biao)(biao)現(xian)出性(xing)(xing)(xing)(xing)別(bie)偏(pian)向(xiang)(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)，其中(zhong)245個表(biao)(biao)(biao)現(xian)出雄性(xing)(xing)(xing)(xing)偏(pian)向(xiang)(xiang)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)和676個雌性(xing)(xing)(xing)(xing)偏(pian)向(xiang)(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)（圖8D）。對有性(xing)(xing)(xing)(xing)別(bie)偏(pian)向(xiang)(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)的(de)circRNA來(lai)源基因做GO和KEGG通路分(fen)析，發現(xian)性(xing)(xing)(xing)(xing)別(bie)偏(pian)向(xiang)(xiang)性(xing)(xing)(xing)(xing)表(biao)(biao)(biao)達(da)(da)的(de)circRNAs有不同的(de)功能，這和分(fen)化成生殖細(xi)胞要求有性(xing)(xing)(xing)(xing)別(bie)特異屬(shu)性(xing)(xing)(xing)(xing)有關（圖8E和8F）。圖8E展(zhan)示的(de)是排名(ming)前10的(de)GO terms，圖8F展(zhan)示的(de)是排名(ming)前10的(de)KEGG通路。

圖8 胚胎生殖(zhi)細胞中circRNAs的鑒定和(he)功能分析

構建ceRNA網絡圖

最近的(de)研究表(biao)明RNAs利用miRNA應答元件（MREs）互相(xiang)調控，這(zhe)一機制叫做競(jing)爭內源性(xing)(xing)(xing)RNA（ceRNA）。通過整合(he)(he)高(gao)通量測序數據中的(de)mRNAs，lncRNAs，circRNAs和(he)miRNAs的(de)表(biao)達分(fen)析和(he)調控關系，構(gou)建ceRNA網絡(luo)圖(tu)（圖(tu)9）。挑選(xuan)了性(xing)(xing)(xing)別偏向性(xing)(xing)(xing)表(biao)達的(de)60個(ge)lncRNAs和(he)29個(ge)circRNA，共有(you)一個(ge)MRE結合(he)(he)位點。例如，lncRNA Meg3和(he)circRNAIgflr預測共同競(jing)爭miRNA miR-15a-5p，其(qi)靶基因是mRNA Inha，Acsl3，Kif21b和(he)Igfbp2。包含有(you)mRNAs，miRNAs，lncRNAs和(he)circRNAs的(de)ceRNA調控網絡(luo)圖(tu)，可能是胚胎生殖細胞獲得分(fen)化(hua)為配子(zi)的(de)性(xing)(xing)(xing)別特異性(xing)(xing)(xing)屬性(xing)(xing)(xing)的(de)重要節點。

圖(tu)9 胚胎生殖細胞中競爭內源性RNA網(wang)絡圖(tu)

文獻來源：

Li X, Ao J, Wu J. Systematic identification and comparison of expressed profiles of lncRNAs and circRNAs with associated co-expression and ceRNA networks in mouse germline stem cells[J]. Oncotarget, 2017, 8(16):26573.