2017-12-14
微衛(wei)星DNA（Microstatellite），又稱簡單重復序列(lie)（Simple Sequence Repeat, SSR），指(zhi)基因(yin)組(zu)中(zhong)由(you)1-6個核苷酸(suan)組(zu)成的串聯重復序列，廣泛分(fen)(fen)布在各種真核生物基因(yin)組(zu)中(zhong)。微衛(wei)星(xing)DNA的兩端一般是比較保守(shou)的單(dan)拷貝序列，據此可(ke)(ke)設(she)計特(te)異引物進行(xing)PCR擴增。根(gen)據串聯重復數(shu)不同，可(ke)(ke)以(yi)揭示(shi)微衛(wei)星(xing)DNA長(chang)(chang)度的多(duo)態(tai)性，而具有長(chang)(chang)度多(duo)態(tai)性的片段可(ke)(ke)用(yong)作分(fen)(fen)子標記(ji)。微衛(wei)星(xing)標記(ji)因(yin)具有多(duo)態(tai)性豐富、分(fen)(fen)布廣泛、遺傳(chuan)共(gong)顯性等(deng)優點(dian)廣泛應用(yong)于遺傳(chuan)圖(tu)譜構建、分(fen)(fen)子標記(ji)輔助(zhu)育種、種質資源鑒定(ding)、遺傳(chuan)多(duo)樣性研究等(deng)領域。
微(wei)衛星(xing)(xing)標(biao)記開(kai)(kai)發(fa)的(de)(de)方(fang)法(fa)有很多，主要可分為(wei)以(yi)下三(san)類(lei)：（1）利用(yong)(yong)數據庫/相關文獻進行搜索和查(cha)找；（2）近緣(yuan)物種間引物交叉(cha)擴增；（3）從gDNA、cDNA、EST中篩選微(wei)衛星(xing)(xing)位點。隨著高通量(liang)測序(xu)(xu)技術的(de)(de)不斷發(fa)展(zhan)，其在微(wei)衛星(xing)(xing)領域中的(de)(de)應用(yong)(yong)也越來越廣泛(fan)。通過高通量(liang)測序(xu)(xu)進行的(de)(de)微(wei)衛星(xing)(xing)標(biao)記開(kai)(kai)發(fa)方(fang)法(fa)主要有：（1）基因組(zu)測序(xu)(xu)（genomic SSR）；（2）轉(zhuan)錄組(zu)測序(xu)(xu)（EST-SSR）；（3）SSR文庫富集(ji)測序(xu)(xu)。本文列舉(ju)了幾種常用(yong)(yong)的(de)(de)基于高通量(liang)測序(xu)(xu)的(de)(de)微(wei)衛星(xing)(xing)DNA開(kai)(kai)發(fa)方(fang)法(fa)及相應的(de)(de)文章解(jie)析，下面就讓小編帶領大家共(gong)同一探究(jiu)竟吧！
1. 基于富集文庫測序的微衛星DNA開發方法
文章題目：High-throughput microsatellite isolation through 454 GS-FLX Titanium pyrosequencing of enriched DNA libraries
發表期刊：Mol Ecol Resour 2011.02 IF: 7.332
研究背景：
無參(can)物(wu)種(zhong)由(you)于(yu)(yu)沒有可(ke)用(yong)的(de)基因組信(xin)息(xi)以及重復(fu)序列從頭組裝困難等問(wen)題(ti)的(de)困擾，使得其微衛星(xing)標(biao)(biao)記(ji)的(de)開(kai)發和利用(yong)存在一(yi)定的(de)限(xian)制。目前(qian)，微衛星(xing)標(biao)(biao)記(ji)的(de)開(kai)發多采用(yong)鳥槍(qiang)法測(ce)(ce)序技(ji)術進行。然而，由(you)于(yu)(yu)隨機測(ce)(ce)序的(de)SSR分離(li)效(xiao)率較低(di)，數據浪(lang)費問(wen)題(ti)比較嚴重。故該研究報道(dao)了一(yi)種(zhong)將SSR文庫富集技(ji)術與焦磷酸測(ce)(ce)序有效(xiao)結合的(de)微衛星(xing)DNA分離(li)方法。
研究方法：
基(ji)因組DNA超聲或酶切打(da)斷(duan)后，利用(yong)8種(zhong)生物(wu)素標記的探(tan)針雜交捕獲SSR序列，將文(wen)庫富集后進(jin)(jin)行(xing)測序，測序平臺為454 GS-FLX。該方法首先在模(mo)式生物(wu)意大利蜜蜂中進(jin)(jin)行(xing)流(liu)程優化，然后在其它13個(ge)物(wu)種(zhong)（含動植物(wu)和(he)真菌）中驗(yan)證和(he)評估有(you)效性(xing)。
研究結果：
在所試驗物(wu)種(zhong)中共獲得11497-34483條序列，微衛星位點(dian)數(shu)量從199至5791不等。研究結果表明，富(fu)集文庫測序能(neng)(neng)夠有(you)效提高(gao)微衛星分離(li)效率，與(yu)不富(fu)集相(xiang)比效率提高(gao)約300%。同時減少不需要的motif類型及比例（如AT motif由于(yu)(yu)難擴增很少用于(yu)(yu)基(ji)因(yin)分型）。因(yin)此，該方(fang)法(fa)能(neng)(neng)夠成功應用于(yu)(yu)許多非(fei)模式物(wu)種(zhong)的微衛星標記開發，且和傳(chuan)統方(fang)法(fa)相(xiang)比，能(neng)(neng)夠有(you)效節(jie)約成本。
2. 簡化基因組測序開發新的亞麻SSR分子標記
文章題目：Development of Novel SSR Markers for Flax (Linum usitatissimum L.) Using Reduced-Representation Genome Sequencing
發表期刊：Fronts Plant Sci 2017.01 IF: 4.298
研究背景：
亞麻(ma)是一種重(zhong)要的(de)纖維和(he)油料作(zuo)物，開發亞麻(ma)的(de)分(fen)(fen)子標(biao)記(ji)對于提高亞麻(ma)產量(liang)和(he)改(gai)善亞麻(ma)質量(liang)具有(you)重(zhong)要意義。目前，RAPD、AFLP和(he)ISSR等(deng)方(fang)法(fa)已(yi)被用(yong)于亞麻(ma)分(fen)(fen)子標(biao)記(ji)的(de)開發，但(dan)這些(xie)方(fang)法(fa)既耗時(shi)耗力，又不能獲得(de)較好的(de)重(zhong)復性(xing)。
研究方法：
采用簡(jian)化基(ji)因組(zu)進行測序(xu)，測序(xu)數據量為(wei)(wei)2G，測序(xu)平臺為(wei)(wei)Illumina HiSeq 2000 （2*100bp），利用SOAPdenovo組(zu)裝后mapping到亞麻參考基(ji)因組(zu)。利用MISA軟件對二至六堿基(ji)核苷(gan)酸重復(fu)的(de)SSR進行搜索；利用Primer Premier軟件進行引物設計。
研究結果：
在亞麻基因組中(zhong)共鑒定到(dao)1720個SSR位點(dian)，其(qi)中(zhong)有1574個SSRs是新發現的。SSRs motif類型主要以(yi)三堿基重復（56.1%）和二堿基重復（35.23%）為主（表1）。
表1 不同類型SSR motif的頻率
采用(yong)(yong)62對(dui)引物對(dui)中(zhong)國(guo)東北部的48種(zhong)亞(ya)(ya)麻(ma)進行(xing)多(duo)態性(xing)鑒定(ding)，發現他們(men)主(zhu)要(yao)(yao)分為纖維(wei)用(yong)(yong)亞(ya)(ya)麻(ma)和油用(yong)(yong)亞(ya)(ya)麻(ma)兩(liang)類（圖1）。值(zhi)得注意的是，在纖維(wei)用(yong)(yong)亞(ya)(ya)麻(ma)中(zhong)，栽培(pei)(pei)種(zhong)“NEW1”和“Venus”的遺傳(chuan)背景顯著不同。類似地，“A0529”的遺傳(chuan)背景也不同于其(qi)他油用(yong)(yong)亞(ya)(ya)麻(ma)。因(yin)此，這(zhe)三(san)個亞(ya)(ya)麻(ma)栽培(pei)(pei)種(zhong)對(dui)亞(ya)(ya)麻(ma)育種(zhong)來說具(ju)有重要(yao)(yao)意義。
圖1 基于SSR分子標記的亞麻遺傳多樣性分析
3. 毛花獼(mi)猴(hou)桃(tao)的轉錄組微(wei)衛星(xing)標記(ji)開發和應用
文章題目：Development and Application of Transcriptome-Derived Microsatellites in Actinidia eriantha (Actinidiaceae)
發表期刊：Fronts Plant Sci 2017.08 IF: 4.298
研究背景：
毛花(hua)獼猴(hou)桃(tao)(tao)是一種(zhong)原產于(yu)(yu)中國的(de)多年生二(er)倍(bei)體木本植物，由(you)于(yu)(yu)維生素C含量高且具有藥(yao)用價值，被視為重要的(de)商業(ye)獼猴(hou)桃(tao)(tao)品(pin)種(zhong)。表達(da)序(xu)列標簽SSRs（EST-SSRs）不僅能揭(jie)示物種(zhong)的(de)適(shi)應性和環(huan)境(jing)的(de)異質(zhi)性，而且由(you)于(yu)(yu)有較(jiao)高的(de)保守性，在不同物種(zhong)間（同屬內）也表現出(chu)較(jiao)好(hao)的(de)可轉移性。
研究方法：
對來自(zi)4個(ge)野生群(qun)體(ti)的(de)8個(ge)毛花獼猴(hou)桃的(de)果實進行轉錄組測(ce)序以開(kai)發微(wei)衛星標(biao)記(ji)，測(ce)序平臺(tai)為Illumina MiSeq。并用其中一個(ge)個(ge)體(ti)驗證(zheng)擴增特(te)異性(xing)，用來自(zi)7個(ge)群(qun)體(ti)的(de)186個(ge)個(ge)體(ti)進行遺(yi)傳(chuan)多樣性(xing)和(he)遺(yi)傳(chuan)結構研究。
研究結果：
通過轉錄(lu)組測序和從(cong)頭組裝產生69783個(ge)非冗(rong)余的(de)(de)功(gong)能基因(yin)，在(zai)(zai)7495個(ge)功(gong)能基因(yin)中共鑒定到8658個(ge)EST-SSR位點(dian)，利(li)用183對(dui)引物進行PCR擴(kuo)增，結(jie)(jie)果顯示(shi)，有69個(ge)位點(dian)具(ju)有多態性(xing)，且(qie)其中61個(ge)位點(dian)能在(zai)(zai)至(zhi)少一(yi)個(ge)物種中擴(kuo)增成功(gong)（圖(tu)2）。隨機(ji)挑選14個(ge)位點(dian)進行遺(yi)傳多樣(yang)性(xing)分析(xi)，進化樹和貝(bei)葉(xie)斯群體結(jie)(jie)構(gou)結(jie)(jie)果顯示(shi)樣(yang)本分為2個(ge)明顯獨立的(de)(de)亞群，與這些樣(yang)本的(de)(de)地理分布一(yi)致（圖(tu)3）。因(yin)此，該研究結(jie)(jie)果對(dui)于毛花獼猴桃遺(yi)傳多樣(yang)性(xing)的(de)(de)研究具(ju)有一(yi)定的(de)(de)指(zhi)導意義。
圖2 毛花獼猴桃功能基因注釋及EST-SSRs的開發流程
圖3 基于14個EST-SSRs的毛花獼猴桃進化樹構建及群體結構分析
