2016-09-13
軍團菌是一種致病菌，由于基因易位等因素具有約300個毒性蛋白。人們對其效應蛋白（effector）的認識較少。特拉維夫大學和芝加哥大學的研究者通過高通量測序得到了 38 株軍團菌基因組的框架圖，并對其編碼效應蛋白的基因進行分析。研究者在 38 個菌株中總共預測得到 5,885 個編碼效應蛋白的基因。進一步研究發現，38 個菌株共有的“核心”效應蛋白僅為 7 個，而其它大部分的效應蛋白具有種間特異性。同時，檢測到很多保守的效應蛋白結構域和相互融合導致的未確定功能的效應蛋白。相關的研究成果于近期發表在Nature Genetics雜志上。
測序、進化和基因組描述
研(yan)究者首(shou)先對來(lai)自軍團菌(jun)屬的(de) 41 個(ge)菌(jun)株(zhu)進(jin)行全基因(yin)組分(fen)析（其中， 38 株(zhu)菌(jun)為(wei)本研(yan)究中測(ce)序的(de)菌(jun)株(zhu)，3 株(zhu)菌(jun)為(wei)已經測(ce)序的(de)參考(kao)基因(yin)組菌(jun)株(zhu)）。結果顯(xian)示，這 41 株(zhu)菌(jun)的(de)基因(yin)組大小在 2.37 Mb~4.82 Mb，GC含量在 36.7%~51.1%。進(jin)化分(fen)析顯(xian)示，這 41 株(zhu)菌(jun)主(zhu)要(yao)可以分(fen)為(wei) 3 個(ge)大的(de)分(fen)支，見圖(tu)1。
圖1 軍團菌屬進(jin)化分析(xi)
Icm/Dot 分泌系統
Icm/Dot型分(fen)泌(mi)系(xi)(xi)(xi)(xi)統（IV B型分(fen)泌(mi)系(xi)(xi)(xi)(xi)統）是軍團(tuan)菌(jun)(jun)屬主要的(de)(de)致病(bing)系(xi)(xi)(xi)(xi)統，由25個基(ji)因編(bian)碼，分(fen)布于兩(liang)個獨(du)立的(de)(de)基(ji)因組區域。對(dui)這(zhe)兩(liang)個區域的(de)(de)基(ji)因結構(gou)進行分(fen)析，發現Icm/Dot區域基(ji)因的(de)(de)順序和方向(xiang)高度保守(shou)。此外，在Icm/Dot 分(fen)泌(mi)系(xi)(xi)(xi)(xi)統中，發現了一些(xie)與(yu)該系(xi)(xi)(xi)(xi)統無關的(de)(de)片段，這(zhe)些(xie)插入片段在不同菌(jun)(jun)株中的(de)(de)大(da)小不等，見圖 2。
圖2 Icm/Dot 分(fen)泌(mi)系(xi)統區域II 在 41 個軍團屬中的分(fen)布
軍團菌屬效應蛋白庫
根據文獻(xian)報道，軍(jun)團(tuan)(tuan)菌屬Icm/Dot 型分(fen)泌系(xi)統(tong)能(neng)轉移(yi)約 300 種效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)。采用機(ji)器學習方法(fa)對 41 個菌株進(jin)行效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)預測，總共(gong)預測得到(dao) 5,885 個效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，可劃分(fen)為 608 個軍(jun)團(tuan)(tuan)屬效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)直(zhi)(zhi)(zhi)系(xi)同(tong)源(yuan)群（LEOGs）。其(qi)中(zhong)(zhong)，63% 的效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)（269 個 LEOGs，包(bao)含(han)3,715 個效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)）為經過實驗驗證的效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)（其(qi)功能(neng)直(zhi)(zhi)(zhi)接采用實驗驗證或其(qi)直(zhi)(zhi)(zhi)系(xi)同(tong)源(yuan)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)采用實驗驗證）；剩余(yu)的效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)（339 個LEOGs，包(bao)含(han) 2,170 個效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)），代表(biao)新(xin)的效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，具有(you)潛在(zai)的新(xin)的功能(neng)。在(zai)所有(you)預測的效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)中(zhong)(zhong)，只有(you) 7 個效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)在(zai)所有(you)分(fen)析菌株中(zhong)(zhong)共(gong)有(you)，稱(cheng)之為“核心效(xiao)應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)”，見(jian)圖 3。
圖3 軍團菌屬效應蛋白的 Venn 圖
軍團菌屬 7 個核心效應蛋白
盡管在軍團菌屬中發現了 608 個 LEOGs，令人驚訝的是，只有其中 7 個為核心效應蛋白，這 7 個蛋白的進化歷史和其物種樹的進化歷史一致。其中 1 個核心效應蛋白（LOG_00212，LegA3）能在目前所有已知的包含 Icm/Dot 分泌系統的細菌基因組中找到同源基因。另外 1 個核心效應蛋白（LOG_00334，MavN）能在軍團菌目中的蟋蟀立克次小體菌（Rickettsiella grylli）基因組中找到同源基因，而不能在貝納特氏立克次體菌（Coxiella burnetii）基因(yin)(yin)組中找到(dao)(dao)同(tong)(tong)(tong)源基因(yin)(yin)。其余的 5 個核心效應(ying)蛋白均不能在上述細菌基因(yin)(yin)組中找到(dao)(dao)同(tong)(tong)(tong)源基因(yin)(yin)，但是能在軍團菌目之外(wai)的細菌基因(yin)(yin)組中找到(dao)(dao)同(tong)(tong)(tong)源基因(yin)(yin)。
為了進一步對這 7 個核心效應蛋白的功能進行分析，研究者在L. pneumophila 菌株中分別構建了這 7 個基因的敲除菌株（單個基因敲除），并研究這些敲除菌株在A. castellanii的細胞內生長情況。結果顯示， LegA3 和 MavN 蛋白部分與該菌在該宿主的細胞內生長所必須。盡管這 7 個效應蛋白的準確功能未知，考慮到這 7 個效應蛋白在軍團菌屬進化過程中高度保守，推測它們可能在侵染過程中起關鍵作用。基因敲除實驗發現，僅有 2 個核心效應蛋白與該菌在宿主細胞內的生長相關，這可能暗示，其余 5 個核心效應蛋白至少在L. pneumophila菌在A. castellanii細胞內的生長是冗余的。當然，這(zhe)些(xie)核心效(xiao)應蛋白可(ke)能(neng)在該菌在其他宿主(zhu)細胞內生(sheng)長所必(bi)須。
軍團菌屬中的(de)菌株特異效應蛋(dan)白
在 608 個 LEOGs 中，258 個 LEOGs 為菌株特異的，即僅在一個軍團菌種中存在。其中，188 個 LEOGs與軍團菌基因組中的其它蛋白顯示局部的序列相似性（E-value < 1×10-4），70 個LEOGs 與軍團(tuan)菌基因(yin)組中的其它蛋白(bai)無序(xu)列相(xiang)似性。
效應蛋白基因的獲(huo)得和丟失
結(jie)合(he)進化(hua)(hua)樹分析效(xiao)應(ying)蛋(dan)白(bai)基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)獲(huo)得與丟(diu)失，結(jie)果顯示(shi)軍團菌(jun)屬中的(de)(de)(de)效(xiao)應(ying)蛋(dan)白(bai)庫(ku)處于動態變化(hua)(hua)中，不(bu)同分支(zhi)的(de)(de)(de)效(xiao)應(ying)蛋(dan)白(bai)獲(huo)得與丟(diu)失的(de)(de)(de)速(su)率不(bu)同。進化(hua)(hua)關(guan)系上(shang)比較接(jie)近的(de)(de)(de)種(zhong)更傾向于具有相似的(de)(de)(de)效(xiao)應(ying)蛋(dan)白(bai)數據集，見圖4。對這些經歷大量的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)水平轉(zhuan)(zhuan)移(yi)效(xiao)應(ying)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)進化(hua)(hua)分析結(jie)果表明，效(xiao)應(ying)蛋(dan)白(bai)基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)基因(yin)(yin)水平轉(zhuan)(zhuan)移(yi)事件更傾向于發生在進化(hua)(hua)關(guan)系接(jie)近的(de)(de)(de)種(zhong)間。
圖4 假定效應蛋白池在軍團菌屬的比較
效應蛋白的共線性和協同進化
在(zai)一些案例(li)中(zhong)，在(zai)基(ji)因(yin)(yin)組中(zhong)處在(zai)相近(jin)位置的(de)效應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)編(bian)碼(ma)(ma)基(ji)因(yin)(yin)在(zai)宿主細胞中(zhong)往往協同起作(zuo)用(yong)。研究者分析了(le)多個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)組中(zhong)連接在(zai)一起的(de)效應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)編(bian)碼(ma)(ma)基(ji)因(yin)(yin)（效應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)之(zhi)間(jian)相鄰不(bu)超過 5 個(ge)(ge)ORFs），總共(gong)(gong)(gong)找到 143 對效應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)編(bian)碼(ma)(ma)基(ji)因(yin)(yin)至少在(zai) 2 個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)組中(zhong)鄰近(jin)，其(qi)中(zhong)，51對效應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)編(bian)碼(ma)(ma)基(ji)因(yin)(yin)組在(zai)至少5個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)組中(zhong)鄰近(jin)。進一步分析這(zhe)些ORFs的(de)共(gong)(gong)(gong)進化(hua)情況，發現這(zhe)些效應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)編(bian)碼(ma)(ma)基(ji)因(yin)(yin)共(gong)(gong)(gong)同獲取或(huo)者丟失的(de)情況遠遠高于偶然幾率，最終確(que)定19對效應(ying)(ying)(ying)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)編(bian)碼(ma)(ma)基(ji)因(yin)(yin)是(shi)共(gong)(gong)(gong)進化(hua)的(de)，并且協同發揮作(zuo)用(yong)。
效應蛋白進化的主因：結構域重組
之前的研究報道，L. pneumophila的(de)(de)(de)(de)(de)效應蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)包(bao)含大(da)量來自(zi)真核(he)(he)生物的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)和(he)效應蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)特異的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)。采用兩種方法對效應蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)保(bao)(bao)守(shou)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)進(jin)行分(fen)析(xi)(xi)：與結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)數據庫中的(de)(de)(de)(de)(de)已知(zhi)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)進(jin)行比對分(fen)析(xi)(xi)；對效應蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)直系(xi)同源(yuan)物的(de)(de)(de)(de)(de)保(bao)(bao)守(shou)區(qu)域(yu)(yu)分(fen)析(xi)(xi)。結(jie)(jie)果顯示，在56%的(de)(de)(de)(de)(de)假定蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)中檢測(ce)到(dao)了保(bao)(bao)守(shou)的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)。99個結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)可通過(guo)上述(shu)兩種方法同時檢測(ce)到(dao)，其中 53 個結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)功能(neng)已知(zhi)（大(da)部分(fen)來自(zi)于真核(he)(he)生物），46 個結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)保(bao)(bao)守(shou)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)，功能(neng)未(wei)知(zhi)。研究者發現(xian)不同的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)經(jing)常分(fen)享相同的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)。將蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)通過(guo)共(gong)有的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)進(jin)行連(lian)接形(xing)成網狀結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)進(jin)行可視化，節點為(wei)共(gong)有的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)，發現(xian)錨蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)重(zhong)復(fu)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)、磷脂(zhi)酰(xian)肌醇-4-磷酸結(jie)(jie)合(he)域(yu)(yu)（PI4P）和(he)富含亮氨酸的(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)復(fu)單(dan)元（LRR）結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)為(wei)最大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)連(lian)接區(qu)域(yu)(yu)，見圖 5。通過(guo)PI4P結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)和(he)LED006對編碼(ma)效應蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)基因進(jin)行預測(ce)分(fen)析(xi)(xi)得到(dao)效應蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)編碼(ma)基因，具體(ti)結(jie)(jie)果見圖6。上述(shu)結(jie)(jie)果驗證了軍團(tuan)菌效應蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)功能(neng)多(duo)樣性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)因以(yi)及結(jie)(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)(gou)域(yu)(yu)重(zhong)組對于軍團(tuan)菌共(gong)進(jin)化的(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)作用
圖 5 效應蛋白的結構網絡
圖 6 包含PI4P或LED006結構域的蛋白結構
結論：
在軍團菌(jun)可(ke)以導致嚴重的(de)疾病大背(bei)景下(xia)，通(tong)過高通(tong)量測序完成了38株軍團菌(jun)的(de)框架圖，并針對其(qi)致病性(xing)(xing)進(jin)行(xing)深入分析。研究了與致病性(xing)(xing)相關(guan)的(de)分泌系統(tong)和效應蛋(dan)白，發現編碼(ma)(ma)分泌系統(tong)的(de)基(ji)(ji)因較為(wei)保守(shou)，而編碼(ma)(ma)效應蛋(dan)白的(de)基(ji)(ji)因差異(yi)較大，只有7個效應蛋(dan)白編碼(ma)(ma)基(ji)(ji)因為(wei)軍團菌(jun)屬核心共(gong)有基(ji)(ji)因。進(jin)一(yi)步分析效應蛋(dan)白多(duo)樣性(xing)(xing)的(de)原(yuan)因發現結構域(yu)重組是其(qi)多(duo)樣性(xing)(xing)的(de)原(yuan)因，而結構域(yu)在不同(tong)的(de)軍團菌(jun)中可(ke)以共(gong)有。
文章亮點：
選(xuan)材(cai)好：選(xuan)取(qu)的(de)材(cai)料(liao)為(wei)人致(zhi)病菌(jun)，受(shou)關注程(cheng)度高；
立足(zu)點好：選取了(le) 38 個軍團菌(jun)(jun)屬(shu)的(de)菌(jun)(jun)株進行測(ce)序，故事內(nei)容主要是(shi)講其致病基因，即效應(ying)蛋白和分泌(mi)系統；
會講故(gu)事(shi)：研究(jiu)者有淺入深(shen)，層(ceng)層(ceng)遞進，完整(zheng)地(di)闡述(shu)了一個(ge)故(gu)事(shi)。
