2016-09-12
派森諾生物(wu)與(yu)上海交通大學農(nong)業(ye)與(yu)生物(wu)學院、復(fu)旦大學生態與(yu)進(jin)化生物(wu)學系共同合(he)作，在《BMC Microbiology》上發表論文，對天然冬蟲(chong)夏草(cao)的內生菌(jun)群及其關(guan)聯(lian)微環境進(jin)行了系統研究。
研究背(bei)景：
Ophiocordyceps sinensis （中文名叫冬(dong)蟲(chong)夏草(cao)(cao)(cao)，DCXC），是一(yi)種(zhong)由(you)寄生(sheng)(sheng)真菌和(he)(he)蟲(chong)共同構(gou)成的(de)(de)復合(he)體，它(ta)具(ju)有地域(yu)偏好性(xing)，主要分(fen)(fen)布于西(xi)藏及周邊省份(fen)的(de)(de)藏族自治區。作為(wei)一(yi)種(zhong)傳(chuan)統(tong)名貴(gui)中藥(yao)(yao)，從天(tian)然蟲(chong)草(cao)(cao)(cao)中提取的(de)(de)生(sheng)(sheng)物活(huo)性(xing)成分(fen)(fen)具(ju)有廣泛(fan)的(de)(de)藥(yao)(yao)理作用，比如抗炎(yan)癥、抗氧化、抗癌、較低血糖(tang)、抗細胞凋亡、免疫調節以及保肝保腎。由(you)于天(tian)然蟲(chong)草(cao)(cao)(cao)的(de)(de)超(chao)高(gao)(gao)藥(yao)(yao)用價值(zhi)，導(dao)致它(ta)被(bei)過(guo)度開(kai)采(cai)，瀕臨(lin)滅(mie)絕。在(zai)過(guo)去數(shu)十年(nian)里(li)，科(ke)學家們致力于天(tian)然蟲(chong)草(cao)(cao)(cao)內(nei)源真菌的(de)(de)分(fen)(fen)離鑒定，但僅通(tong)過(guo)傳(chuan)統(tong)分(fen)(fen)離培(pei)養的(de)(de)方(fang)法分(fen)(fen)析過(guo)有限數(shu)量(liang)的(de)(de)蟲(chong)草(cao)(cao)(cao)個體。隨(sui)著(zhu)高(gao)(gao)通(tong)量(liang)測序技術的(de)(de)飛速發(fa)展普(pu)及，全面研究天(tian)然蟲(chong)草(cao)(cao)(cao)的(de)(de)菌群組成、結構(gou)和(he)(he)功能活(huo)性(xing)迫在(zai)眉睫。
研(yan)究(jiu)目的：
本研究對天然蟲(chong)草進行(xing)分子(zi)普查，揭示其群落的(de)組(zu)成(cheng)、結構(gou)和功能活性(xing)，為天然蟲(chong)草的(de)遺傳多(duo)樣性(xing)及功能探究奠定基礎，并(bing)為保護(hu)稀有的(de)天然蟲(chong)草提供(gong)可(ke)持(chi)續發(fa)展(zhan)的(de)生物技術模型(xing)。
研究(jiu)方(fang)法：
本研究從3個(ge)(ge)(ge)取樣(yang)(yang)位點分別(bie)采集5—10個(ge)(ge)(ge)天然蟲(chong)草(cao)，獲(huo)得子座（Stroma）和菌(jun)核（Sclerotia）兩個(ge)(ge)(ge)內(nei)生菌(jun)群樣(yang)(yang)本，以及外部皮層(ceng)菌(jun)絲體（External mycelial cortices）和周邊土壤(rang)（Soil）兩個(ge)(ge)(ge)關聯微環境樣(yang)(yang)本，通過(guo)Roche 454 FLX+焦磷酸測序技術，分別(bie)對細(xi)菌(jun)16S rRNA基因的V1-V3可變區和真菌(jun)的ITS區序列進行測序分析。
圖1 天然蟲草樣本采集信息
分析內(nei)容與結果說明：
1.蟲草內生菌群和關聯微環境的多樣性比較
在本研(yan)究中(zhong)，通過對(dui)16S rRNA基(ji)因和ITS區(qu)的焦磷酸高通量測序，總獲得44,588條細菌(jun)16S rRNA V1-V3可變區(qu)序列和51,584條真菌(jun)ITS區(qu)序列，在97%的序列相似度下，分別歸并得到(dao)14,975和9427個OTU。有意思(si)的是，外(wai)部(bu)皮層(ceng)菌(jun)絲體和周邊(bian)土壤兩個微(wei)環境中(zhong)的微(wei)生(sheng)物多樣(yang)性，遠遠高于蟲草(cao)自身（子座和菌(jun)核）的多樣(yang)性。
表1 天然蟲(chong)草內(nei)生菌(jun)群和關(guan)聯微(wei)環境的多樣性統計表
2.菌群類型不同，組成結構大相庭徑
將細菌(jun)(jun)和(he)(he)(he)真(zhen)菌(jun)(jun)群(qun)落(luo)分(fen)別(bie)與SILVA和(he)(he)(he)UNITE數據庫進行比(bi)對發現，在(zai)門(men)水(shui)平的(de)細菌(jun)(jun)群(qun)落(luo)中(zhong)(zhong)，Proteobacteria是(shi)最優勢(shi)群(qun)落(luo)，在(zai)子座(zuo)、菌(jun)(jun)核、外部(bu)皮層菌(jun)(jun)絲體和(he)(he)(he)周(zhou)邊土壤中(zhong)(zhong)，分(fen)別(bie)占(zhan)68.4%、49.5%、38.9%和(he)(he)(he)35.6%；真(zhen)菌(jun)(jun)群(qun)落(luo)中(zhong)(zhong)，Ascomycota最為優勢(shi)，在(zai)上述四個菌(jun)(jun)群(qun)中(zhong)(zhong)，分(fen)別(bie)占(zhan)21.0%、45.6%、26.4%和(he)(he)(he)59.3%。 在(zai)屬水(shui)平的(de)細菌(jun)(jun)群(qun)落(luo)中(zhong)(zhong)，Pseudomonas（9.24%）和(he)(he)(he)Rhodoferax（9.11%）在(zai)菌(jun)(jun)核中(zhong)(zhong)最為優勢(shi)，Pedobacter (8.05%)和(he)(he)(he)Rhodoferax (6.91%)的(de)豐(feng)度在(zai)子座(zuo)中(zhong)(zhong)占(zhan)據前兩位(wei)，而外部(bu)皮層菌(jun)(jun)絲體中(zhong)(zhong)豐(feng)度最高的(de)是(shi)Thermomonas (3.43%)和(he)(he)(he)Gemmatimonas (2.13%)，周(zhou)邊土壤樣本中(zhong)(zhong)豐(feng)度最高的(de)是(shi)Ferruginibacter (3.07%)和(he)(he)(he)Gemmatimonas (2.22%)。
真菌群(qun)落中，Entoloma在(zai)菌核（2.62%）和外部皮層菌絲體（3.47%）中最(zui)為優(you)勢。在(zai)子座中，Exophiala (2.90%)、Cladophialophora (1.77%)和Phaeomollisia (1.45%)最(zui)為優(you)勢，而在(zai)土壤(rang)中，Cladophialophora (3.30%)和Verrucaria (3.10%)的豐(feng)度高居前兩(liang)位。
圖2 四個類型的細菌和真菌菌群在門水平的組成
3.不同類型群落間的相似性
通過PCoA主(zhu)坐標分析進一步發現，周邊(bian)土壤和(he)外部(bu)皮層(ceng)菌(jun)(jun)(jun)絲體中的(de)細菌(jun)(jun)(jun)群(qun)落更(geng)為相似，并與子座和(he)菌(jun)(jun)(jun)核群(qun)落差異明顯。對于(yu)真菌(jun)(jun)(jun)群(qun)落而言，菌(jun)(jun)(jun)核和(he)外部(bu)皮層(ceng)菌(jun)(jun)(jun)絲體之間的(de)菌(jun)(jun)(jun)群(qun)結(jie)構(gou)則更(geng)為相似。
圖3 細菌與真菌群落的主坐標分析（PCoA）
4.樣品中細菌與真菌總豐度的定量驗證
最后，研究人(ren)員通(tong)過(guo)熒光定量PCR的(de)(de)方法，比(bi)較(jiao)了不同(tong)(tong)菌(jun)群類型中細(xi)(xi)菌(jun)和真菌(jun)群落(luo)總(zong)量的(de)(de)高低。T檢(jian)驗表(biao)明，真菌(jun)群落(luo)的(de)(de)總(zong)量顯(xian)著高于(yu)細(xi)(xi)菌(jun)群落(luo)（P<0.05），同(tong)(tong)時，土(tu)壤(rang)群落(luo)中細(xi)(xi)菌(jun)和真菌(jun)的(de)(de)總(zong)量均(jun)顯(xian)著高于(yu)其(qi)它類型的(de)(de)菌(jun)群（P<0.05）。
圖4 不同類型的菌群中細菌和真菌總量的比較分析
研究結論：
本研(yan)究通(tong)過(guo)454焦磷酸高通(tong)量測序的方(fang)法(fa)，對天然蟲(chong)(chong)草內(nei)生(sheng)菌群及(ji)其關聯微(wei)生(sheng)境的微(wei)生(sheng)物組成結構和(he)多樣性(xing)進行了全面系統的研(yan)究，從而揭示了天然蟲(chong)(chong)草不同類型菌群中的本質(zhi)差(cha)異，并為從微(wei)生(sheng)態學(xue)角(jiao)度解(jie)釋天然蟲(chong)(chong)草的具有(you)(you)超高藥用(yong)價(jia)(jia)值(zhi)提供(gong)了依據。也(ye)為自然界(jie)中具有(you)(you)生(sheng)物活性(xing)和(he)潛在藥用(yong)價(jia)(jia)值(zhi)的其它(ta)天然物質(zhi)提供(gong)了應(ying)用(yong)新思路。
原文索引：
Fei Xia, Yan Liu, Meng-Yuan Guo, Guang-Rong Shen, Juan Lin2 and Xuan-Wei Zhou. Pyrosequencing analysis revealed complex endogenetic microorganism community from natural DongChong XiaCao and its microhabitat. BMC Microbiology (2016) 16:196;doi10.1186/s12866-016-0813-5
