2016-09-08
隨著三代(dai)測序(xu)技術的(de)成熟，得到了(le)越來越多(duo)的(de)科(ke)研工作者的(de)認可。關于三代(dai)測序(xu)的(de)文章數(shu)量，近年來不斷地增長，很多(duo)發表(biao)在SCI的頂級期刊(kan)上，比(bi)如利用三(san)代(dai)測序技(ji)術(shu)開展(zhan)轉(zhuan)錄組測序，可獲得mRNA的全長信(xin)息和(he)基因結構信(xin)息，這類研究(jiu)的文章影響因子基本是10分以(yi)上。說到這里，各位老師、學者們(men)是不是已經(jing)按耐不住了呢？
今(jin)天小編就三代(dai)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組(zu)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序的(de)技(ji)術(shu)(shu)原理(li)帶領大(da)家縱觀全長轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組(zu)的(de)時(shi)代(dai)！三代(dai)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序又稱單分子(zi)(zi)實(shi)時(shi)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序技(ji)術(shu)(shu)（Single Molecule Real-Time sequencing，SMRT），是指對(dui) DNA 分子(zi)(zi)進行(xing)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序時(shi)，不需要經過擴(kuo)增(zeng)，實(shi)現對(dui)每一條(tiao) DNA 分子(zi)(zi)進行(xing)單獨測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序的(de)技(ji)術(shu)(shu)。將三代(dai)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序應用在(zai)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組(zu)測(ce)(ce)(ce)(ce)(ce)序中，可以真實(shi)反映動植物基(ji)因組(zu)結構信(xin)息，獲得全長轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)組(zu)。
眾所周知，應用二(er)代轉錄(lu)組(zu)測(ce)(ce)序技術，無(wu)論是(shi)有參(can)考(kao)基因(yin)組(zu)還是(shi)無(wu)參(can)考(kao)基因(yin)組(zu)，都需要(yao)拼接(jie)成一(yi)(yi)個完整(zheng)的(de)(de)轉錄(lu)本(ben)，那(nei)么問題來了，二(er)代測(ce)(ce)序下機(ji)的(de)(de)都是(shi)短片段(duan)，要(yao)得到(dao)原始的(de)(de)轉錄(lu)本(ben)信(xin)息，就需要(yao)對短片段(duan)進行拼接(jie)。通過PacBio所獨有的(de)(de)環(huan)形(xing)一(yi)(yi)致性(xing)測(ce)(ce)序（Circular-consensus sequence，CCS）模(mo)式，可(ke)(ke)以(yi)極大地(di)提高測(ce)(ce)序的(de)(de)準確率，一(yi)(yi)般而言，將序列(lie)循環(huan)測(ce)(ce)序5~6次后，獲得的(de)(de)一(yi)(yi)致性(xing)序列(lie)的(de)(de)準確率可(ke)(ke)以(yi)達到(dao)99.99%（QV40）以(yi)上，遠遠超過了二(er)代測(ce)(ce)序的(de)(de)準確率。
平臺較量
加利福尼亞太平洋(yang)生物科學公司（Pacific Biosciences of California, Inc., PacBio）推(tui)出的三代測序平臺主要有兩大系(xi)(xi)(xi)列(lie)，即 RS 系(xi)(xi)(xi)列(lie)和 Sequel 系(xi)(xi)(xi)列(lie)。其中(zhong)，RS II 系(xi)(xi)(xi)列(lie)于2013年(nian)4月(yue)份推(tui)出，通(tong)量(liang)(liang)為(wei) 500 Mb ~ 1 Gb /SMRT Cell；Sequel 系(xi)(xi)(xi)列(lie)于2015年(nian)9月(yue)份推(tui)出，該系(xi)(xi)(xi)列(lie)與 RS II 系(xi)(xi)(xi)列(lie)測序原(yuan)理相同，但測序通(tong)量(liang)(liang)有了(le)很大的提(ti)升，單(dan)個 SMRT Cell 的測序通(tong)量(liang)(liang)為(wei) RS II 系(xi)(xi)(xi)列(lie)的 7 倍。目前，國內應用最為(wei)廣泛的仍然是 RS II 系(xi)(xi)(xi)列(lie)。但是小(xiao)編所在的公司派(pai)森諾生物已經(jing)訂(ding)購(gou)了(le)一(yi)臺 Sequel。以下表(biao)格就(jiu)是兩大系(xi)(xi)(xi)列(lie)的對(dui)比：
二代、三代建庫流程較量
而對(dui)(dui)于建(jian)庫來(lai)說，三代也比二代分外簡單，具體流程(cheng)對(dui)(dui)比如下圖所(suo)示：
圖1 三代轉錄組測序建庫流程
圖2 二代轉錄組測序建庫流程
從建庫流程(cheng)我們(men)也可(ke)以看到(dao)，無需磁珠(zhu)富集mRNA，三(san)代(dai)轉錄組(zu)測序只要用隨(sui)機引(yin)物將(jiang)RNA樣品進(jin)行反(fan)轉錄形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)cDNA，再通過(guo)將(jiang)cDNA跑E膠選擇目的片度(du)（如(ru)3K-5K），切(qie)膠回(hui)收后再進(jin)行一輪擴增、加環狀接頭(tou)后形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)CCS，即可(ke)上(shang)機。（其中環狀接頭(tou)序列為5’–pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT– 3’前面綠色(se)和后面藍(lan)色(se)反(fan)向互補，形(xing)成配對，中(zhong)間(jian)序(xu)列成環，整個(ge)形(xing)成發卡結構。）一(yi)個(ge)文(wen)庫對應一(yi)個(ge)SMRT Cell，單個(ge) SMRT Cell 的(de)運(yun)行時間(jian)為 2~6 h，每個(ge)SMRT Cell有15萬個(ge)零模波導孔（ZMWs），不同(tong)片(pian)段(duan)(duan)長度(du)的(de)文(wen)庫進入孔的(de)效(xiao)率不同(tong)，一(yi)般(ban)小片(pian)段(duan)(duan)文(wen)庫進入孔的(de)效(xiao)率高；由于三(san)代(dai)測序(xu)過程(cheng)中(zhong)無需擴增，因而(er)避(bi)免(mian)了測序(xu)覆蓋的(de)不均一(yi)性，也(ye)沒有GC 偏好性。
全長轉錄組測序小結
綜上所述，基于(yu)三(san)代(dai)測序(xu)(xu)平臺RS II 和(he)Sequel，技術(shu)上我(wo)們(men)省(sheng)(sheng)時又省(sheng)(sheng)力，不(bu)論是RNA的(de)(de)(de)總量（≥1μg）還(huan)是建庫步驟(zou)，較二代(dai)的(de)(de)(de)測序(xu)(xu)的(de)(de)(de)流(liu)程都簡明(ming)了(le)很多；其次，我(wo)們(men)可以(yi)得到轉錄組目標片段的(de)(de)(de)全(quan)長以(yi)及轉錄本的(de)(de)(de)表達量等信息，解決(jue)了(le)擴(kuo)增(zeng)cDNA序(xu)(xu)列3‘或5’端的(de)(de)(de)技術(shu)難題。目前關于(yu)三(san)代(dai)測序(xu)(xu)的(de)(de)(de)文章數(shu)量不(bu)斷(duan)地增(zeng)長，連同二代(dai)測序(xu)(xu)一(yi)起(qi)研究的(de)(de)(de)文章也是不(bu)勝枚舉(ju)，下一(yi)期我(wo)們(men)就針對具體的(de)(de)(de)文獻(xian)，結合三(san)代(dai)的(de)(de)(de)分析再(zai)跟大家一(yi)起(qi)分享！
