2017-11-17
三代(dai)單(dan)分子測序(xu)一個十分重要的(de)優(you)勢是能夠同(tong)時獲得(de)基(ji)因組中的(de)甲基(ji)化(hua)修飾信息。當基因組中某位點存在堿基修飾時，測序速度會變慢，Pacbio公司得出檢測算法，可以識別m6A、m5C和m4C的甲基化修飾。近(jin)年來(lai)，甲基(ji)化研(yan)究熱度(du)居高(gao)不下。在細菌基(ji)因(yin)組中，N6-甲(jia)基腺嘌呤（m6A）和N4-甲(jia)基胞嘧啶（m4C）很常見，它們作為限制修飾（RM）系統的(de)一部分(fen)行(xing)使重要(yao)功能。三代(dai)單分(fen)子實時（SMRT）測序技(ji)術的(de)出(chu)現，為甲基化(hua)位點的(de)定位提供了簡單高效(xiao)的(de)方法(fa)，事實上，三代(dai)測序所能提供的(de)甲基化(hua)信息(xi)遠比(bi)我們想(xiang)象中豐富。
分子生物學(xue)經典雜志《Nucleic Acids Research》（影響因(yin)子10.162）中刊登(deng)了一(yi)篇文章，通過對12株(zhu)結核分枝桿菌（MTBC）進行三代測序，深度挖掘“精確(que)甲基化”信息。
研究(jiu)方法(fa)：
借助SMRT測序技術和二代亞硫酸氫鹽甲基化測序，鑒定屬于不同MTBC譜系的12種MTBC菌株的甲基化位點。通過數據庫比對和分子生物學實驗鑒定了3個m6A序列motif及其相應的MTase基因。此外，通過計算“The methylated-motif-site ratio”和“The methylated-read ratio”，研究每個甲基化修飾位點的甲基化狀態和序列讀取，獲得MTBC菌株的精確甲基化信息。
測(ce)序平臺(tai)：PacBio RS II&Illumina HiSeq
研究結果：
1、MTBC菌株(zhu)全(quan)基因組(zu)甲(jia)基化(hua)狀態（12株(zhu)）
對(dui)12株菌基于三代數據進行(xing)甲基化(hua)分析，共找到3個甲基化(hua)motif。表格中統計的(de)Motif數量包括在正鏈(lian)和負鏈(lian)上的(de)甲基化(hua)數目，結果(guo)中可(ke)以看出(chu)，并非所(suo)有的(de)motif序列都是被(bei)修飾的(de)。
2、未甲基(ji)化(hua)motif在基(ji)因區(qu)(GR)和基(ji)因間區(qu)(IGR)區(qu)域的分布
研究人員總結了未甲基化motif在基因組當中的分布情況，表中括號中的數字表示半甲基化（一條鏈被甲基化）。結果顯示，有相當比例的GATN4TAC未甲基化位點分布在IGR中，它們大多位于起始密碼子上游50bp，而大多數的激活子位于起始密碼子上游70~80bp處，因此這些位點保持未甲基化狀態可能是為了保證有關基因順利轉錄。
3、甲基化reads比例
以(yi)SMRT測序reads為研究對象定義(yi)公式：甲(jia)基(ji)化reads比例（The methylated-read ratio）=甲(jia)基(ji)化reads數/包含motif的(de)reads數，結果(guo)如表(biao)中所示。由(you)此定義(yi)了MTBC菌株(zhu)的(de)“精確甲(jia)基(ji)化”，“精確的(de)甲(jia)基(ji)化”顯(xian)示在具有(you)活性(xing)MTase的(de)MTBC菌株(zhu)中存在未(wei)甲(jia)基(ji)化的(de)基(ji)序位點。
4、MTase基因(yin)預測及MTase基因(yin)中(zhong)的SNP/Indel位點分布
在REBASE數據庫(ku)中比對預測得到(dao)MTBC菌(jun)株中3個有活性(xing)的(de)(de)甲基(ji)化基(ji)因——mamA、mamB、hsdM，并進(jin)行了(le)分子(zi)生物學的(de)(de)鑒(jian)定。由于(yu)突(tu)變(bian)/缺失，MTase活性(xing)在12個菌(jun)株之間變(bian)化。通過檢(jian)測MTase基(ji)因中的(de)(de)SNP/Indel位(wei)點分布觀察到(dao)，大多數未修飾(shi)的(de)(de)位(wei)點與轉(zhuan)錄因子(zi)結合區重(zhong)疊，可能保護了(le)這(zhe)些(xie)位(wei)點免受(shou)甲基(ji)化。
結論
使用SMRT測序技術，鑒定屬于不同MTBC譜系的12種MTBC菌株的甲基化位點，以及3個m6A序列motif及其相應的MTase基因。此外，研究人員還通過計算“The methylated-motif-site ratio”和“The methylated-read ratio”，研究每個甲基化修飾位點的甲基化狀態和序列讀取，以獲得MTBC菌株的精確甲基化信息，同時使MTase的復雜活性能夠在全基因組測序中被分析。
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文章索引(yin)
Lingxiang Zhu, Jun Zhong, Xinmiao Jia, et al.
