2016-08-25
派森諾生物與武漢水產研究所、華中農業大學共同合作，在《Fish & Shell?sh Immunology》（影響因子3.025）發表論(lun)文，對感(gan)染(ran)和(he)未感(gan)染(ran)柱(zhu)狀黃桿菌的鱖(gui)魚的頭腎組織樣(yang)本進行測(ce)序，探討免疫(yi)相關基因的作用(yong)，為防治柱(zhu)形(xing)病提供(gong)新思路。
一、研究背景
柱狀黃桿菌(Flavobacterium cloumnare)為(wei)柱(zhu)(zhu)形(xing)病(bing)的病(bing)原菌，魚類被感染后的主要表(biao)(biao)現包(bao)括(kuo)魚鰭破損、爛鰓和表(biao)(biao)皮潰瘍，對水產(chan)業造成嚴重經濟(ji)損失。鱖魚是亞洲(zhou)國家重要的經濟(ji)魚類，近年來鱖魚柱(zhu)(zhu)形(xing)病(bing)發病(bing)率明顯增加(jia)。本文(wen)探討鱖魚被柱(zhu)(zhu)狀黃桿菌侵(qin)染后的基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達調(diao)控機制(zhi)，為(wei)防治柱(zhu)(zhu)形(xing)病(bing)提(ti)供分(fen)子基(ji)礎。
二、材料
選取5月齡鱖魚，平均體重68.5±12.1 g， 置于25-26℃淡水循環的系統里喂養。柱狀黃桿菌在Shieh培養基培養，收集，濃度調整到5×108CFU/ml。
隨(sui)機(ji)選(xuan)取(qu)六條(tiao)鱖魚，腹腔注射137 ml 柱狀黃桿(gan)菌，對照組(zu)則(ze)注射等(deng)體積的(de)Shieh培養(yang)基。36小(xiao)時后(hou)當注射柱狀黃桿(gan)菌的(de)魚游(you)動行為出現異常，立即取(qu)頭腎組(zu)織并(bing)凍在液氮中。提取(qu)樣本的(de)總(zong)RNA，構建文庫(ku)，利(li)用Illumina HiSeq平(ping)臺(tai)上機(ji)測序，并(bing)進行數據分析。
三、結果
1.感染組和未感染組間的差異表達基因及GO、KEGG富集分析
分析差(cha)異(yi)表達基因軟件為DESeq，使用表達倍數(shu)差(cha)異(yi)和p-value篩選(xuan)標準，結果得到1019個(ge)差(cha)異(yi)基因，包括(kuo)603個(ge)上調基因和416個(ge)下調基因。
圖(tu)1 差異(yi)基因(yin)的火山圖(tu)和MA圖(tu)
圖2 表(biao)達差異基因(yin)的GO富集(ji)分析
圖3 表達差異基因的KEGG富集分析
2.分析與免疫反應相關的差異的基因
在差異表達(da)基(ji)因(yin)(yin)中找到27個(ge)(ge)與免疫相關的(de)基(ji)因(yin)(yin)，包(bao)括17個(ge)(ge)上調基(ji)因(yin)(yin)和10個(ge)(ge)下調基(ji)因(yin)(yin)，這27個(ge)(ge)免疫相關基(ji)因(yin)(yin)的(de)序列已被證實(shi)并列入NCBI基(ji)因(yin)(yin)數據庫。
3.qPCR驗證差異表達基因
為驗(yan)證(zheng)轉錄(lu)組測序(xu)的結果，隨機挑選6個基(ji)因用于qPCR驗(yan)證(zheng)，兩(liang)種(zhong)實驗(yan)模式(shi)下上(shang)下調的趨勢一致。
圖4 qPCR驗證結(jie)果
四、討論：
由(you)于實驗樣本的(de)鱖魚頭腎(shen)組織為免疫器官，下面針(zhen)對17個上調(diao)和10個下調(diao)的(de)免疫反應相關基因進行(xing)具(ju)體討(tao)論。
1.細胞(bao)因子相關基因
細(xi)(xi)胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)由大量的細(xi)(xi)胞(bao)(bao)產生，在免(mian)疫(yi)應答和造(zao)血(xue)系統中扮(ban)演重要角色。細(xi)(xi)胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)綁(bang)定到特(te)定的靶細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的膜受體，觸發信號轉導通路，最終改變靶細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的基因(yin)表達。
2.補體系統
補(bu)體系統是(shi)(shi)一(yi)個(ge)非常重(zhong)要的(de)先天免(mian)疫系統的(de)一(yi)部(bu)分，它補(bu)充(chong)抗體和(he)吞噬細胞清除受感(gan)染的(de)生物的(de)病原體。結果中(zhong)3個(ge)補(bu)體因子是(shi)(shi)表達上(shang)調，包括C8α 和(he) C6β，表明感(gan)染FC的(de)鱖魚中(zhong)經典的(de)和(he)備選的(de)補(bu)體旁路(lu)均被激活，補(bu)體通路(lu)激活的(de)細節還需(xu)在(zai)未來深入研(yan)究(jiu)。
3.細胞凋亡
細(xi)胞凋亡是一個無處不(bu)在(zai)的過程，涉(she)及(ji)到許多蛋(dan)白(bai)質和(he)(he)重要的是宿主(zhu)清除(chu)病原體(ti)。結(jie)果中，細(xi)胞色素C (Cyt C) 和(he)(he) CASP3表達(da)上調(diao)，而(er)熱休克蛋(dan)白(bai)70(Hsp70)則表達(da)下調(diao)，Cyt C和(he)(he)CASP3可以促進(jin)細(xi)胞凋亡。
4.激酶
感染FC后的鱖魚中(zhong)有兩(liang)個激(ji)(ji)酶(AMPK和ZAP-70)表達(da)下調，AMPK在細(xi)(xi)胞(bao)能量平衡中(zhong)發揮作用，包括刺激(ji)(ji)脂(zhi)肪酸氧化和抑制脂(zhi)肪生(sheng)成；ZAP-70是(shi)T細(xi)(xi)胞(bao)受體的一部分，在T細(xi)(xi)胞(bao)激(ji)(ji)活中(zhong)扮演重(zhong)要角色，隨后促進T細(xi)(xi)胞(bao)分化、增殖和細(xi)(xi)胞(bao)因子分泌。而兩(liang)個激(ji)(ji)酶下調的機制還需(xu)再研(yan)究。
5.鐵代謝
值(zhi)得注意(yi)的(de)是(shi)(shi)(shi)，感染(ran)FC后的(de)鱖魚(yu)中鐵(tie)(tie)調素的(de)表達(da)是(shi)(shi)(shi)未感染(ran)組的(de)126倍(bei)，是(shi)(shi)(shi)免疫(yi)相(xiang)關基因中差異最明顯(xian)的(de)。鐵(tie)(tie)調素是(shi)(shi)(shi)由(you)25-84個氨(an)基酸構成的(de)短(duan)肽，主(zhu)要(yao)由(you)肝(gan)臟(zang)產生(sheng)，具有殺菌的(de)性(xing)能(neng)，已有研(yan)究證明炎(yan)癥(zheng)狀態下鐵(tie)(tie)調素水平會升(sheng)高。可見鐵(tie)(tie)離子(zi)的(de)調節是(shi)(shi)(shi)預防細菌感染(ran)的(de)重要(yao)策(ce)略。
6.細胞信號蛋(dan)白激酶(mei)
細(xi)胞(bao)信號(hao)是(shi)(shi)調節細(xi)胞(bao)活動和協調細(xi)胞(bao)行為的(de)(de)一個復雜(za)的(de)(de)基本通(tong)信系統。鈣調蛋(dan)白(CaM)是(shi)(shi)一個小的(de)(de)、高度保守的(de)(de)蛋(dan)白質，通(tong)過結(jie)合鈣離子能(neng)傳感信號(hao)。SHC-轉(zhuan)化細(xi)胞(bao)表面受體的(de)(de)蛋(dan)白質傳輸信號(hao)，如表皮生長(chang)因(yin)子受體(EGFR)和胰島(dao)素(su)受體。14-3-3蛋(dan)白是(shi)(shi)一類(lei)在所(suo)有真核細(xi)胞(bao)中表達(da)(da)的(de)(de)保守的(de)(de)調控分子，可(ke)以(yi)結(jie)合多種(zhong)功能(neng)不同的(de)(de)信號(hao)蛋(dan)白，包括激酶(mei)、磷酸酶(mei)和跨膜受體。鱖魚感染FC以(yi)后(hou)SHC2表達(da)(da)下(xia)調，而Ca Ml-6 和 14-3-3表達(da)(da)上調，意味著處理組(zu)和對照組(zu)之間復雜(za)的(de)(de)相關性(xing)。
參考文獻
Zhou W, et al. Analysis of the transcriptomic profilings of Mandarin fish (Siniperca chuatsi) infected with Flavobacterium columnare with an emphasis on immune responses. Fish & shellfish immunology 43(1):111-119.
