2016-08-12
派森諾生物與上海海洋大學水產資源開發與利用重點實驗室共同合作，在《PLOS ONE》發表論文，首(shou)次揭示了草魚抵抗(kang)嗜水氣(qi)單胞菌感(gan)染(ran)的(de)免(mian)疫應答機制。
1. 研究背景
草魚(yu)（Ctenopharyngodon idella），又名鯇魚、草(cao)鯇、烏青(qing)、混子，棲息于平原地區的江河(he)湖泊。嗜水氣(qi)單胞菌（Aeromonas hydrophila）廣泛分布于自(zi)然界的(de)(de)(de)各(ge)種(zhong)水(shui)體，是多種(zhong)水(shui)生動物的(de)(de)(de)原發性致病菌(jun)。長期以來，草(cao)魚(yu)對嗜(shi)水(shui)氣單胞(bao)(bao)菌(jun)較易(yi)感，感染(ran)(ran)個體有較高的(de)(de)(de)死(si)亡率，給漁業資源(yuan)造成較大的(de)(de)(de)經濟損失(shi)。嗜(shi)水(shui)氣單胞(bao)(bao)菌(jun)入侵魚(yu)體后，先(xian)在腸(chang)道內增殖，再經門動脈(mo)循(xun)環進入肝(gan)臟、腎臟及(ji)其(qi)它組織，引起肝(gan)臟、腎臟等器(qi)官以及(ji)血液病變，繼而出現全身癥狀。那么，嗜(shi)水(shui)氣單胞(bao)(bao)菌(jun)感染(ran)(ran)草(cao)魚(yu)后，草(cao)魚(yu)機體的(de)(de)(de)免疫系統是怎樣做出應答(da)反應的(de)(de)(de)，基(ji)因(yin)轉錄組水(shui)平的(de)(de)(de)相(xiang)關研(yan)究還很少(shao)。
2. 研究目的
RNA-Seq研究表明多種魚類如娃娃魚、青海(hai)湖裸魚、大(da)菱鲆(ping)等遭(zao)嗜(shi)水氣(qi)單胞菌(jun)侵染后，與免(mian)疫應答(da)相(xiang)關的結構和(he)功能基因表(biao)達發生了顯著變化(hua)。為了研究嗜(shi)水氣(qi)單胞菌(jun)感染草(cao)魚后，草(cao)魚體內的免(mian)疫應答(da)機制(zhi)，中國海洋大學水產資(zi)源開發與利用重點實驗室的黨(dang)云飛等對感染前后不同(tong)時間段(duan)的草魚脾臟組(zu)織進行了轉錄組(zu)測序。
3. 研究方法
本(ben)研究草(cao)魚(yu)樣(yang)本(ben)采自(zi)江蘇(su)吳江國家農場(chang)，飼養在用高(gao)錳(meng)酸鉀滅菌的循(xun)環水體中，每天飼(si)喂三次。實驗組草(cao)魚腹膜內(nei)注射100ul 2.7 × 107 CFU/mL嗜水(shui)氣(qi)單(dan)胞菌，對照組(zu)草魚(yu)注射(she)(she)相同體積的PBS。實驗組(zu)草魚(yu)注射(she)(she)嗜水(shui)氣(qi)單(dan)胞菌后4, 8, 12, 24, 48 和72 h分別取魚的脾臟組織，并立即用(yong)液氮速(su)凍，保存在-80℃冰箱(xiang)。后(hou)續對(dui)每個樣本分別提取總RNA進行建庫測序(xu)。
4. 分析內容與結(jie)果(guo)說明
4.1序列拼接與unigene功能注釋
通(tong)過(guo)RNA-seq無參轉(zhuan)錄組數據分(fen)析，序列拼接共得到52,668 unigenes，平均長度為1,072bp，具體拼接結果見表1。
表1 序列拼接結果
圖1 草魚unigene E-value分(fen)布圖
4.2 Unigene功能注釋
將拼接得到的所有unigenes 與NR數(shu)據庫(ku)比對(dui)，并對(dui)其進行GO, eggNOG, KEGG功能注(zhu)釋(shi)，結果顯示unigene主要分布在“cytoplasm” (9,944)，“plasma membrane” (4,144)，“cytosol” (3,726)等功(gong)能，具(ju)體注釋(shi)結果見表2，圖2。
表2 Unigene注釋結(jie)果(guo)
圖2 草魚unigene GO功能注(zhu)釋（A）和eggNOG功能注(zhu)釋(shi)（B）
4.3 草魚轉錄本進化保守性分析
為了評估草(cao)魚unigene序列的保守性(xing)，用BlastX方法(fa)將草(cao)魚序列與其他五種模(mo)式魚（斑馬(ma)魚、河豚、棘(ji)魚、青鳉和(he)鲀）數據庫進行比較(jiao)，結果顯(xian)示有38,910 (73.88%) unigenes共同存(cun)在于五種(zhong)魚(yu)類中，結果(guo)見圖3。
圖3 草魚unigene保守性(xing)分析(xi)
4.4 基因表達差異分析
將實驗組4, 8, 12, 24, 48 和72 h的測序結(jie)果(guo)分別與(yu)對(dui)照組0 h進行基因表達差異分析，6個(ge)比較組共(gong)得到2,992 DEGs。這些DEGs共參與(yu)39個(ge)通路，其(qi)中(zhong)參與(yu)免(mian)疫系統相關通路的有89個(ge)DEGs。從圖4中(zhong)可以看出(chu)，“complement and coagulation cascades” 補體系統是較(jiao)多DEGs參與的(de)通(tong)路，說(shuo)明草(cao)魚在遭(zao)嗜水氣單胞菌(jun)感染后(hou)，補(bu)體成分(fen)在免疫應答中發揮著重(zhong)要作用。
圖4 差異基(ji)因參與的免疫相關(guan)通路
4.5 補(bu)體系統相(xiang)關(guan)DEGs qPCR驗證
為了進一(yi)步驗(yan)證草魚在感染(ran)嗜水氣(qi)單胞菌后(hou)天然免疫系統(tong)相關DEGs的表達(da)量(liang)變化，研(yan)究(jiu)者共挑選了18個DEGs進(jin)行了qPCR實(shi)驗，圖5是部(bu)分qPCR驗證結果(guo)。結果(guo)顯示微管(guan)蛋(dan)白（TUBB）和組織蛋白酶S(CTSS)在感染后4-12 h顯(xian)著上調；還有一些(xie)與補體通路相(xiang)關(guan)的基因如MARCO、CHMP5、MHCI的表達量(liang)也出現明(ming)顯(xian)上調，并(bing)且與轉錄組(zu)測(ce)序的結果(guo)一致(zhi)。
圖5 qPCR驗證(zheng)
5. 研究結論
人工(gong)養殖(zhi)條件下的(de)草(cao)(cao)魚(yu)病(bing)害較多，提高草(cao)(cao)魚(yu)抗病(bing)力是增加養殖(zhi)產量的(de)重(zhong)要途徑之一(yi)。由嗜水氣單胞菌感染(ran)引起的魚(yu)類(lei)疾病給漁業(ye)生產造(zao)成(cheng)了嚴(yan)重危(wei)害，本研(yan)究通過第二代高通量測序技術在轉錄組水(shui)平(ping)上揭示了草魚(yu)機體(ti)抵抗病菌感染的天(tian)然免(mian)(mian)疫(yi)(yi)應答反應，為進(jin)一步研(yan)究免(mian)(mian)疫(yi)(yi)相關基因之(zhi)間的網絡調(diao)控關系(xi)提供(gong)了有利(li)數據。同時，也為更好的進(jin)行(xing)草魚(yu)飼(si)養提供(gong)了幫助。
6. 原文索引
Dang Y, Xu X, Shen Y, et al. Transcriptome Analysis of the Innate Immunity-Related Complement System in Spleen Tissue of Ctenopharyngodon idella Infected with Aeromonas hydrophila.[J]. Plos One, 2016, 11(7).
