2016-06-27
派森諾生物與上海農業科學院生物技術研究所、上海農業遺傳和育種重點實驗室共同合作，在《Plant Cell Rep》（影響因子3.09）發表論文，通過轉錄(lu)組分析鹽脅迫(po)下(xia)花粉培養的(de)(de)大(da)麥胚性愈傷組織發(fa)現了(le)一個(ge)重要的(de)(de)翻譯抑制和細胞(bao)防御系統中蛋白質特(te)有選擇性激活(huo)。
一、研究背景
土壤鹽堿化是限制植(zhi)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)長(chang)和(he)降低農(nong)作物(wu)(wu)生(sheng)產(chan)力(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要(yao)非生(sheng)物(wu)(wu)脅(xie)(xie)迫(po)之一。在(zai)本研究中，觀察到鹽脅(xie)(xie)迫(po)下不(bu)(bu)僅影響(xiang)大(da)麥(mai)花粉培(pei)養的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)胚(pei)性(xing)愈傷組(zu)織(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)量，還影響(xiang)后期生(sheng)長(chang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)質量。大(da)麥(mai)花粉培(pei)養的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)胚(pei)性(xing)愈傷組(zu)織(zhi)是連(lian)接細胞(bao)和(he)植(zhi)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一個(ge)(ge)短(duan)暫(zan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)中間形式，通過轉錄組(zu)測序分析對細胞(bao)適(shi)應(ying)脅(xie)(xie)迫(po)提供了新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)理解。轉錄組(zu)分析已經成為(wei)一個(ge)(ge)研究和(he)識別潛(qian)在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可能機制重要(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方法(fa)(fa)。采用(yong)這(zhe)種(zhong)方法(fa)(fa)，研究各種(zhong)脅(xie)(xie)迫(po)誘導小孢子(zi)胚(pei)胎(tai)發生(sheng)和(he)基(ji)因表達變化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)有(you)好幾種(zhong)作物(wu)(wu)，包括煙草、番茄、大(da)麥(mai)和(he)小麥(mai)。然而(er)單倍體細胞(bao)或成型的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)胚(pei)胎(tai)如何在(zai)連(lian)續的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脅(xie)(xie)迫(po)下生(sheng)存且最終發展為(wei)整個(ge)(ge)植(zhi)物(wu)(wu)目前尚不(bu)(bu)清楚。
二、材料與方法
選取大麥品種 (Hordeum vulgare L.)（中(zhong)國(guo)長江三(san)角(jiao)洲(zhou)地區廣泛種(zhong)(zhong)植的(de)大(da)麥品種(zhong)(zhong)，由上海農業科學院(yuan)種(zhong)(zhong)植），2013年(nian)11月(yue)播(bo)種(zhong)(zhong)，次年(nian)4月(yue)收集。收集到(dao)的(de)麥棱放在(zai)4°C 2周，通過壓碎消毒麥穗(sui)的(de)花(hua)粉囊來收集花(hua)粉。收集到(dao)的(de)花(hua)粉被(bei)過濾和離心(xin)分離，最(zui)后(hou)在(zai)誘導培養(yang)(yang)基(ji)(ji)培養(yang)(yang)。培養(yang)(yang)基(ji)(ji)上的(de)純花(hua)粉粒培養(yang)(yang)作(zuo)為(wei)(wei)對照(zhao)組(zu)(zu)，培養(yang)(yang)基(ji)(ji)含有(you)500毫(hao)克/L 的(de)NaCl作(zuo)為(wei)(wei)鹽脅迫組(zu)(zu)，每個(ge)組(zu)(zu)四個(ge)生物學重復。經過21天培養(yang)(yang)后(hou)，對每個(ge)培養(yang)(yang)基(ji)(ji)里形成(cheng)胚性(xing)愈(yu)傷組(zu)(zu)織進(jin)行(xing)分離和測(ce)量(liang)。收集部分胚性(xing)愈(yu)傷組(zu)(zu)織到(dao)離心(xin)管中(zhong)，放在(zai)液(ye)氮中(zhong)，再放到(dao)-80℃保存。剩下的(de)胚性(xing)愈(yu)傷組(zu)(zu)織進(jin)行(xing)稱重并轉移到(dao)另(ling)外一(yi)個(ge)培養(yang)(yang)基(ji)(ji)上培養(yang)(yang)一(yi)個(ge)月(yue)左(zuo)右(you)。
三、結果
1、鹽脅迫對胚性愈傷組織和植株的影響
檢查鹽脅迫的影響在(zai)胚胎發(fa)生(sheng)的愈(yu)傷組(zu)織(zhi)的形成和分(fen)化，觀察四(si)個(ge)生(sheng)物重復，發(fa)現與(yu)對(dui)照相比，加入鹽脅迫的培養基(ji)里面的可見的粒(li)子愈(yu)傷組(zu)織(zhi)少一(yi)些。如(ru)圖1a所(suo)示：
圖(tu)1a)兩(liang)組(zu)胚性(xing)愈(yu)傷組(zu)織的生長對比(bi)；b）胚性(xing)愈(yu)傷組(zu)織及植株的產量對比(bi)
與對照組相比，鹽脅(xie)迫下培(pei)養的(de)愈(yu)(yu)傷組織(zhi)的(de)平(ping)均重量(liang)(濕重)的(de)下降(jiang)一半(ban)，從158.0毫克(ke)降(jiang)到83.4毫克(ke)(圖1 b)。結果表明，胚(pei)性愈(yu)(yu)傷組織(zhi)的(de)形成和生長(chang)的(de)植株都受到鹽脅(xie)迫的(de)顯著影響(xiang)，這意味著長(chang)時間(jian)處在鹽環境中對愈(yu)(yu)傷組織(zhi)的(de)數量(liang)和質量(liang)都會造成損傷。
2、挑選部分差異基因進行熒光定量PCR驗證
通過測序，對(dui)照組(zu)和鹽脅(xie)迫組(zu)分別得(de)到70,809,030 和 82,220,750 raw reads。如圖2是挑選(xuan)的16個差異基因的q-PCR結果(guo)，結果(guo)表明鹽組(zu)相(xiang)對(dui)于對(dui)照組(zu)，5個小熱休克(ke)蛋白基因表達水平明顯上調(diao)，而(er)NUP205， RPLP0， RPLP2， CDC48， e IF1A， VARS，GST， THOC2這(zhe)(zhe)八個基因在鹽脅(xie)迫組(zu)中表達明顯下調(diao)。這(zhe)(zhe)些基因的驗證(zheng)結果(guo)與(yu)RNA-seq的結果(guo)一致。
圖2：熒光定量(liang)PCR結果(guo)
3、表達差異基因的KEGG富集分析
對照組和(he)鹽脅迫組比(bi)較共發(fa)現(xian)123個表達上調的(de)基因(yin)(yin)和(he)473個表達下調的(de)基因(yin)(yin)，通(tong)過KEGGpathway的(de)分析發(fa)現(xian)有120個差異基因(yin)(yin)富集(ji)到(dao)功能(neng)通(tong)路(lu)上，有的(de)基因(yin)(yin)可能(neng)參與多個通(tong)路(lu)。
圖(tu)3：差異基因(yin)的KEGG富集(ji)分析
四、討論：
1、小熱休克蛋白在鹽脅迫下的影響
熱休克蛋白(HSPs)被是一個分子伴侶大(da)家族，參與蛋白質(zhi)折疊、裝配、易位和(he)退化，在保(bao)護植物免受脅(xie)迫起到(dao)至關重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)作用。在研究(jiu)中(zhong)發現鹽(yan)(yan)脅(xie)迫下的(de)(de)(de)(de)樣品中(zhong)有12個熱休克蛋白基(ji)因是上調(diao)的(de)(de)(de)(de)，各種脅(xie)迫可能(neng)擾亂新合成的(de)(de)(de)(de)多肽折疊而導(dao)致的(de)(de)(de)(de)蛋白質(zhi)在內質(zhi)網(wang)上積累稱為(wei)內質(zhi)網(wang)膜應激。研究(jiu)表(biao)明(ming)，熱休克蛋白的(de)(de)(de)(de)激活可能(neng)對于(yu)緩解由于(yu)鹽(yan)(yan)脅(xie)迫引(yin)起的(de)(de)(de)(de)內質(zhi)網(wang)應激發揮(hui)重(zhong)要作用。
2、適應鹽脅迫的翻譯調整
KEGG富(fu)集分(fen)(fen)析中(zhong)，有27個差(cha)異(yi)基(ji)因富(fu)集到了“翻(fan)譯(yi)”通路上。通路中(zhong)鹽(yan)脅迫組(zu)中(zhong)幾乎所有的(de)差(cha)異(yi)基(ji)因都是下調的(de)，它們(men)主要分(fen)(fen)布在“rRNA”、“tRNA合成”，“mRNA檢(jian)測通路”，“真核(he)生物核(he)糖體生物合成”。表(biao)明(ming)連續的(de)鹽(yan)脅迫導(dao)致(zhi)(zhi)胚(pei)性(xing)愈傷組(zu)織翻(fan)譯(yi)的(de)加(jia)強來(lai)適當的(de)控制細胞蛋白(bai)質(zhi)合成來(lai)應對環境(jing)壓力導(dao)致(zhi)(zhi)的(de)蛋白(bai)質(zhi)合成抑制。
研究(jiu)發(fa)現鹽脅迫(po)組(zu)(zu)中三大亞基(ji)核(he)(he)糖體(ti)蛋白(bai)基(ji)因(yin)(RPL40、RPLP0 RPLP2)表達(da)下(xia)調，這意(yi)味著核(he)(he)糖體(ti)蛋白(bai)基(ji)因(yin)被抑(yi)制來減少蛋白(bai)質(zhi)的(de)合成來應對鹽脅迫(po)；研究(jiu)還(huan)發(fa)現，鹽脅迫(po)組(zu)(zu)中轉錄起始(shi)因(yin)子(zi)e IF1A的(de)表達(da)明顯(xian)下(xia)調，兩種編碼(ma)RNA合成酶的(de)基(ji)因(yin)VARS、FARSA表達(da)下(xia)調，表明翻譯起始(shi)收到鹽脅迫(po)的(de)抑(yi)制。
五、結論：
轉錄組數據(ju)對鹽脅(xie)(xie)迫(po)下的(de)(de)(de)細胞(bao)防(fang)御的(de)(de)(de)基(ji)因表(biao)達提供了(le)一(yi)個新的(de)(de)(de)見解。結果(guo)顯示(shi)，在連續的(de)(de)(de)鹽脅(xie)(xie)迫(po)下，細胞(bao)防(fang)御系統為(wei)調控基(ji)礎(chu)(chu)蛋白質合成引起(qi)了(le)全面的(de)(de)(de)翻譯(yi)抑制(zhi)，同時一(yi)系列(lie)熱休克被選擇性地(di)激活來約(yue)束變性蛋白質起(qi)著至關重要的(de)(de)(de)作用。這些為(wei)了(le)適應鹽環境(jing)的(de)(de)(de)轉錄調整可能會影響胚(pei)性愈傷(shang)組織的(de)(de)(de)一(yi)些基(ji)礎(chu)(chu)蛋白的(de)(de)(de)合成以及(ji)后續的(de)(de)(de)生長。
文案(an) 產品運(yun)營部轉(zhuan)錄組產品線 徐寧寧
