2016-06-17
派森諾與中(zhong)國科學(xue)院西(xi)雙版(ban)納熱帶植物園熱帶森林(lin)生態學(xue)重(zhong)點(dian)實驗室共同合作，在《BMC Genomics》（影響因子3.867）發(fa)表論文，首次揭示(shi)了(le)影響孩兒參二型花發(fa)育的(de)網絡調控(kong)機制。
1. 研究背景
孩兒參（拉丁名：Pseudostellaria heterophylla），又名太子參，是石竹科孩兒參屬的一種；為多年生草本植物多年生草本，高15-20厘米。以根入藥，有補氣益血、生津、補脾胃的作用。孩兒參花期4-6月，分為開花受粉花和閉花受粉花，即在同一植株上既可生長出開花受粉花(chasmogamous,CH)，又可生長出閉花受粉花(cleistogamous, CL)。開花授粉是很多植物在開花后的一種授粉方式，閉花受粉是花朵在授粉期時與外界隔絕，即花在未開放時就完成了授粉，如豌豆。受季節和環境因素的影響，孩兒參生長CH和CL兩種花型的能力也會隨著變化，春天生長開花授粉花，夏天生長出閉花授粉花。大麥和水稻也是閉花受粉植物，研究表明，大麥中的閉花受粉基因Cly1是microRNA miR172作用的靶基因，miR172的定點突變會導致Cly1基因表達下調，進而抑制花朵漿片的生長才產生了閉花受粉花。孩兒參作為一種特殊的二態型閉花授粉植物，為研究開花受粉和閉花受粉的基因調控網絡提供了很好的模型。然而在全基因轉錄組水平調控孩兒參兩種花型產生的分子機制及調控漿片網絡是怎樣的，相關研究還很少。目前NCBI上還沒有公布孩兒參的參考基因組序列，本研究對進一步完善其基因組信息也具有重要意義。
2. 研究目的
孩(hai)兒(er)參(can)開(kai)花(hua)(hua)(hua)受粉(fen)花(hua)(hua)(hua)和閉(bi)花(hua)(hua)(hua)受粉(fen)花(hua)(hua)(hua)開(kai)在不同的季節，受季節和環境(jing)因素影(ying)響較(jiao)大，這(zhe)些外界因素作用(yong)于(yu)植(zhi)物機體會(hui)導致一些基(ji)因的表(biao)達量發生(sheng)變化，如(ru)果這(zhe)些變化的基(ji)因正是有關開(kai)花(hua)(hua)(hua)和閉(bi)花(hua)(hua)(hua)的，就會(hui)產(chan)生(sheng)兩種(zhong)不同的花(hua)(hua)(hua)型(xing)。為了研(yan)究孩(hai)兒(er)參(can)開(kai)花(hua)(hua)(hua)受粉(fen)花(hua)(hua)(hua)和閉(bi)花(hua)(hua)(hua)受粉(fen)花(hua)(hua)(hua)中轉錄組水(shui)平的基(ji)因表(biao)達差異和影(ying)響這(zhe)兩種(zhong)不同花(hua)(hua)(hua)型(xing)產(chan)生(sheng)的基(ji)因調(diao)控網絡，中國科學院西(xi)雙版納(na)熱(re)帶植(zhi)物園(yuan)熱(re)帶森林生(sheng)態學重點實驗室羅艷博士(shi)和她的團隊對孩(hai)兒(er)參(can)進行了RNA-Seq研(yan)究。
3. 研究方法
本(ben)(ben)研究樣本(ben)(ben)均(jun)采(cai)(cai)自(zi)山東半島東南岸靠(kao)近東海的嶗山上，開花(hua)授粉花(hua)采(cai)(cai)自(zi)四月份(fen)，閉花(hua)授粉花(hua)于五月份(fen)采(cai)(cai)集(ji)，每種花(hua)型包括(kuo)3-5個不(bu)同生長階段的花(hua)蕾(lei)。樣本(ben)(ben)采(cai)(cai)集(ji)后均(jun)立(li)即液氮(dan)冷凍，-80℃保存。提取總RNA后，通(tong)過安(an)捷倫2100檢測樣品質量與(yu)完整性，使用Illumina TruSeq RNA sample preparation kit進(jin)行(xing)文庫構建，并(bing)通(tong)過Hiseq2000平臺上機測序。
圖(tu)1 孩兒(er)參兩種(zhong)不同花(hua)(hua)型(xing)（a-d:開花(hua)(hua)授粉花(hua)(hua)；e-h:閉花(hua)(hua)授粉花(hua)(hua)）
4. 分析內容與結果說明
4.1 序列拼接與unigene功能注釋
通過RNA-seq無參轉(zhuan)錄組數據分(fen)析，序列(lie)拼接共得到(dao)44,603 unigenes，平(ping)均長度為(wei)860bp，具體(ti)(ti)拼接結果見(jian)表1。拼接得到(dao)的(de)所有(you)unigenes 與(yu)NR數據庫比對(dui)，并對(dui)其進行GO, eggNOG, KEGG功(gong)能注(zhu)釋，其中eggNOG注(zhu)釋把所有(you)unigenes分(fen)成了25類(lei)，在這些功(gong)能分(fen)類(lei)中，與(yu)信號轉(zhuan)導相關的(de)unigenes占(zhan)8.01%，與(yu)轉(zhuan)錄相關的(de)unigenes占(zhan)5.91%，具體(ti)(ti)注(zhu)釋結果見(jian)圖2。
表(biao)1 數據拼接結果(guo)
圖2 eggNOG 功能注釋
NR數(shu)據(ju)庫比(bi)對結(jie)果還發(fa)現，孩兒參中與開(kai)花相(xiang)關的(de)基因(yin)有(you)428個(ge)，這些(xie)基因(yin)參與開(kai)花時間的(de)調控、花組織與器官的(de)形成與發(fa)育等。
4.2 RNA-seq差異表達分析
差(cha)(cha)異(yi)(yi)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)分(fen)析(xi)結(jie)果顯(xian)示(shi)在(zai)(zai)CH和(he)CL兩(liang)種花型中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)共有396個(ge)(ge)差(cha)(cha)異(yi)(yi)表達基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)（差(cha)(cha)異(yi)(yi)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)篩(shai)選條件fold-change >4, FDR<0.05），其(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)有93個(ge)(ge)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)在(zai)(zai)CH花中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)表達上調，303個(ge)(ge)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)在(zai)(zai)CL花中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)表達上調。此外，分(fen)析(xi)結(jie)果還發現(xian)有3個(ge)(ge)轉(zhuan)錄本在(zai)(zai)CH花中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)特異(yi)(yi)表達，57個(ge)(ge)轉(zhuan)錄本在(zai)(zai)CL花中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)特異(yi)(yi)表達。進一步對差(cha)(cha)異(yi)(yi)表達基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)進行GO富集(ji)分(fen)析(xi)發現(xian)大部分(fen)差(cha)(cha)異(yi)(yi)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)功能主要集(ji)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)在(zai)(zai)對內源、外源刺激及外界環境脅(xie)迫的應(ying)答反應(ying)，這些功能也恰(qia)好解釋了為什么(me)CH和(he)CL兩(liang)種花會(hui)開在(zai)(zai)不同的季節。
圖3 差(cha)異(yi)基因GO富集分析
注：藍色(se)代(dai)表CL花(hua)中上調(diao)(diao)基(ji)因，紅色(se)代(dai)表CH花(hua)中上調(diao)(diao)基(ji)因
4.3 qPCR驗證
與開花調控網絡相關的24個關鍵基因進行(xing)qPCR驗證，其中差(cha)異基因FKF1, FT, STM, AP1, AP3, 和 PI 的RNA-seq與qPCR結(jie)果趨(qu)于一致；CRY2, PHY, CO, SOC1, AGL24等基因無(wu)表達差(cha)異，分(fen)析結(jie)果見圖(tu)4。
圖4 RNA-seq 與qPCR驗(yan)證
4.4 兩種花型基因調控網絡分析
CH和(he)CL兩種花(hua)(hua)(hua)(hua)型(xing)分(fen)別生長(chang)在(zai)不同的(de)季節，是外(wai)界環境的(de)影(ying)響(xiang)導(dao)致一些與(yu)開花(hua)(hua)(hua)(hua)相關的(de)關鍵(jian)基因(yin)的(de)表(biao)達(da)(da)(da)發生了變(bian)(bian)化。在(zai)閉花(hua)(hua)(hua)(hua)授粉花(hua)(hua)(hua)(hua)生長(chang)時(shi)期，晝夜長(chang)短(duan)的(de)改變(bian)(bian)導(dao)致FKF1表(biao)達(da)(da)(da)量下(xia)調(diao)，光照質量變(bian)(bian)低導(dao)致FT基因(yin)表(biao)達(da)(da)(da)量下(xia)調(diao)，二者低水(shui)平表(biao)達(da)(da)(da)對(dui)延遲(chi)開花(hua)(hua)(hua)(hua)時(shi)間具(ju)有重要作(zuo)用。另外(wai)，STM基因(yin)在(zai)花(hua)(hua)(hua)(hua)生長(chang)發育(yu)過程中具(ju)有調(diao)節花(hua)(hua)(hua)(hua)型(xing)、節間生長(chang)以及腋(ye)生分(fen)生組織的(de)作(zuo)用，并可促進花(hua)(hua)(hua)(hua)組織分(fen)裂相關基因(yin)AP1的(de)表(biao)達(da)(da)(da)上(shang)調(diao)。在(zai)上(shang)游基因(yin)的(de)作(zuo)用下(xia)，與(yu)花(hua)(hua)(hua)(hua)瓣和(he)雄蕊生長(chang)相關基因(yin)AP3和(he)PI的(de)表(biao)達(da)(da)(da)量下(xia)調(diao)，最終導(dao)致閉花(hua)(hua)(hua)(hua)授粉花(hua)(hua)(hua)(hua)的(de)形成。兩種花(hua)(hua)(hua)(hua)型(xing)的(de)基因(yin)網絡調(diao)控關系見(jian)圖(tu)5。
圖5 CH和CL花型(xing)基因調控網絡分析
注：空白格代(dai)(dai)(dai)表(biao)(biao)(biao)基因表(biao)(biao)(biao)達(da)量(liang)(liang)不發生(sheng)變化，紅色代(dai)(dai)(dai)表(biao)(biao)(biao)表(biao)(biao)(biao)達(da)量(liang)(liang)上調，綠(lv)色代(dai)(dai)(dai)表(biao)(biao)(biao)表(biao)(biao)(biao)達(da)量(liang)(liang)下(xia)調；箭頭表(biao)(biao)(biao)示(shi)促(cu)進，垂線表(biao)(biao)(biao)示(shi)抑(yi)制
5. 結論
本(ben)研究表(biao)(biao)明孩兒參兩種(zhong)不同花(hua)型的產生是受不同季節外界(jie)環(huan)境的影響(xiang)，外界(jie)環(huan)境的作用(yong)導致機體內與開(kai)花(hua)相關(guan)的一(yi)(yi)些關(guan)鍵基(ji)因(yin)（FKF1, CO, FT, STM, AP1,AP3,PI等）的表(biao)(biao)達(da)發生了變化。通過基(ji)因(yin)之間的網絡(luo)調(diao)控作用(yong)，最終與花(hua)瓣和(he)雄(xiong)蕊生長相關(guan)基(ji)因(yin)AP3和(he)PI的表(biao)(biao)達(da)受到抑(yi)制，形成閉花(hua)授粉(fen)花(hua)。另一(yi)(yi)方面(mian)也說明孩兒參二(er)型花(hua)的產生是為了更(geng)好的適(shi)應外界(jie)環(huan)境，為研究閉花(hua)授粉(fen)植物提供(gong)了很好的模型。
參考文獻
Luo Y, Hu J, Li L et al., Genome-wide analysis of gene expression reveals gene regulatory networks that regulate chasmogamous and cleistogamous flowering in Pseudostellaria heterophylla (Caryophyllaceae). BMC Genomics (2016) 17:382
