2016-06-13
本期(qi)我們以鴨疫(yi)里默(mo)氏桿菌（Riemerellaanatipestifer）Yb2為材(cai)料，學習如何借助Miseq平臺進行全基(ji)因組序列分析，鑒定毒力(li)基(ji)因！該研究(jiu)成果(guo)由中國科學院上海獸醫(yi)研究(jiu)所的于(yu)圣青(qing)團隊在線發表在國際著名學術期刊《Applied and Environmental Microbiology》(IF:3.668)，其中測序和(he)分析(xi)工作由上海派森諾生物科技(ji)股份有限公司(si)完成。
研究(jiu)背景
鴨疫里默氏桿(gan)菌(jun)是(shi)一種能夠引(yin)起雞(ji)、鴨、鵝等鳥(niao)類(lei)患(huan)流行性(xing)傳染性(xing)漿膜炎的(de)細菌(jun)，能夠給(gei)養鴨業帶(dai)來嚴重的(de)經濟損(sun)失。不同的(de)血清型(xing)和菌(jun)株之間毒(du)力變化很大，目前除了(le)毒(du)力因子VAPD，CAMP溶血素和外(wai)模蛋(dan)白的相(xiang)關報道，其他關于鴨疫里默氏桿(gan)菌致(zhi)病的分子(zi)基礎知識報道很少。本研究通過Miseq平臺完成(cheng)了對鴨疫里默氏桿(gan)菌Yb2的全基因組序列分析，借助隨(sui)機轉座子(zi)誘變和體內篩選鑒定出49個毒力基因，該數據對未來鴨疫里默氏桿菌基(ji)礎發(fa)病(bing)機制的研究提供遺傳基(ji)礎。
材料和方法
材(cai)料選取：
1、野生(sheng)型鴨(ya)疫里默氏桿菌Yb2
2、雛(chu)鴨(ya)（來自上(shang)海莊(zhuang)行(xing)鴨(ya)場）進行(xing)轉座子隨機突(tu)變和減毒突(tu)變體(ti)的分離
測序(xu)平(ping)臺：Illumina MiSeq平(ping)臺
文庫：PE400和MP8K
分析內(nei)容(rong)
1、Yb2基因的預(yu)測和注(zhu)釋(shi)
2、Yb2基因(yin)組的(de)進化分(fen)析：SNP分(fen)析；共線性分(fen)析；同(tong)源(yuan)性分(fen)析和系統發育樹重構(gou)
3、突變基(ji)因(yin)的鑒定和生物信(xin)息(xi)學分(fen)析
研究結果
1、鴨疫里默氏桿菌(jun)Yb2基因組特征
菌株(zhu)Yb2有一個(ge)單(dan)一環狀的(de)染色體，無證據證明(ming)質粒的(de)存在，預測(ce)有一個(ge)CRISPR序列，有七個(ge)假基(ji)因，2021個(ge)開放閱讀框(kuang)（ORF），平均長(chang)度976bp。KEGG注釋(shi)結果顯示，1217個(ge)ORFs被分到30不同的(de)代(dai)謝途徑。
2、進化分析
對菌株DSM15868、RA-GD、RA-CH-1、RA-CH-2 和 Yb2 進行單核苷酸多態位點（SNP）、共線性和同源性分析發現RA-GD和Yb2的遺傳距離最近。
3、隨(sui)機轉座子誘變和(he)減毒突變株(zhu)的分離
通(tong)過(guo)Tn4351插(cha)入突(tu)(tu)變失活構建突(tu)(tu)變體庫，利用動(dong)物(wu)體內篩(shai)選獲得(de)超過(guo)100倍(bei)衰減毒力(li)的突(tu)(tu)變體，通(tong)過(guo)轉座(zuo)子插(cha)入失活鑒(jian)定(ding)出49個毒力(li)基因。
4、突變基因編碼蛋白(bai)的生物信(xin)息(xi)學分(fen)析
通過PSORTb預測得到49個毒力基(ji)(ji)因(yin)編(bian)(bian)碼蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)的亞(ya)細(xi)胞位置。其(qi)中，25個基(ji)(ji)因(yin)編(bian)(bian)碼產物為細(xi)胞質(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)，6個基(ji)(ji)因(yin)編(bian)(bian)碼產物為細(xi)胞質(zhi)膜(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)，4個基(ji)(ji)因(yin)編(bian)(bian)碼產物為外膜(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)，剩(sheng)下的14個基(ji)(ji)因(yin)編(bian)(bian)碼產物的亞(ya)細(xi)胞定位尚不清楚。
結果展(zhan)示圖
圖1. Yb2基因組注釋和GC偏移
圖(tu)2 鴨疫里默(mo)氏桿(gan)菌基因組序列示(shi)意圖(tu)
總結
通過(guo)轉(zhuan)座子隨(sui)機突變(bian)、體內(nei)篩選完成了鴨疫里默氏桿(gan)(gan)菌YB2的全基(ji)因組(zu)序列(lie)分析，鑒(jian)定(ding)出49個毒力基(ji)因，該研究(jiu)為(wei)后續細菌鴨疫里默氏桿(gan)(gan)菌感染(ran)的耐藥(yao)性(xing)和持久性(xing)提供指(zhi)導。
參考(kao)文獻(xian)：
Wang X, Ding C, Wang S, et al. Whole-Genome Sequence Analysis and Genome-Wide Virulence Gene Identification of Riemerellaanatipestifer Strain Yb2. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(15): 5093-5102.
