2016-06-13
外顯子組測序基本概念
外顯子：真(zhen)核生(sheng)物基因的一部分，能夠在RNA 剪切后保留下來(lai)并作為成熟RNA 產物的一部分。
外顯(xian)子組(zu)：一個物種(zhong)基因組(zu)中全部外顯(xian)子區(qu)域的總和。
外顯子組(zu)測序：對一個物種基(ji)因組(zu)中(zhong)全部外顯子區域進行測(ce)序的(de)技術。主(zhu)要包括兩步：獲取基(ji)因組(zu)中(zhong)全部外顯子區域；采用高通量(liang)的(de)測(ce)序技術對這些區域進行測(ce)序。
外顯子組測序基本流程
外顯子(zi)(zi)組(zu)測序的基(ji)本流(liu)程如圖，即利(li)用(yong)(yong)物理或化學手段(duan)對基(ji)因(yin)組(zu) DNA 進(jin)行片段(duan)化，采用(yong)(yong)雜(za)交或 PCR 擴增(zeng)的方法富集外顯子(zi)(zi)，采用(yong)(yong)高通量測序平臺對獲得(de)的序列進(jin)行測序，并進(jin)行生(sheng)物信息分析(xi)，獲得(de)變異信息。
外顯子捕獲平臺
在整個(ge)外(wai)顯子組測序流(liu)程中，外(wai)顯子捕獲是關鍵環節(jie)，現有的捕獲手段按照(zhao)捕獲原理可(ke)以(yi)分(fen)為兩(liang)大(da)類(lei)：即雜交(jiao)法(fa)(fa)和多重(zhong) PCR 擴增(zeng)法(fa)(fa)。按照(zhao)雜交(jiao)的環境(jing)分(fen)為固相(xiang)(xiang)和液(ye)相(xiang)(xiang)雜交(jiao)，按照(zhao)PCR擴增(zeng)方式分(fen)為多重(zhong)PCR和分(fen)子倒置探針。基(ji)于這些方法(fa)(fa)開發(fa)出(chu)的相(xiang)(xiang)應平(ping)臺和技術參數見下(xia)表。
基(ji)于(yu)(yu)多(duo)重 PCR 的(de)目標(biao)(biao)區(qu)域(yu)富集方法，在(zai)捕獲(huo)目標(biao)(biao)區(qu)域(yu)時(shi)，需(xu)要(yao)進行 PCR 擴增，因此對(dui)樣(yang)品的(de)起(qi)始(shi)量(liang)要(yao)求低(di)；同(tong)時(shi)由于(yu)(yu)不同(tong)區(qu)域(yu) PCR 的(de)擴增效率不同(tong)，容(rong)易(yi)出現擴增偏愛性，導(dao)致不同(tong)目標(biao)(biao)區(qu)域(yu)覆蓋均一(yi)性差，并(bing)且在(zai) PCR 擴增過程中容(rong)易(yi)引入堿(jian)基(ji)錯誤(wu)。該方法主要(yao)適用于(yu)(yu)目標(biao)(biao)區(qu)域(yu)捕獲(huo)片段(duan)較(jiao)小(xiao)且樣(yang)品起(qi)始(shi)量(liang)比較(jiao)低(di)的(de)情況。
基于(yu)雜(za)交的(de)(de)(de)目(mu)(mu)(mu)標(biao)(biao)區(qu)域富集方法，對目(mu)(mu)(mu)標(biao)(biao)區(qu)域的(de)(de)(de)覆蓋均勻，不引入錯誤；其缺點(dian)是對樣品的(de)(de)(de)起始量(liang)要(yao)求(qiu)高。該方法主(zhu)要(yao)適(shi)用(yong)于(yu)全外(wai)顯(xian)子(zi)組捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)測序或者較大目(mu)(mu)(mu)標(biao)(biao)區(qu)域的(de)(de)(de)捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)測序。目(mu)(mu)(mu)前(qian)，主(zhu)流的(de)(de)(de)全外(wai)顯(xian)子(zi)捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)平臺主(zhu)要(yao)包括 NimbleGen公(gong)司開發的(de)(de)(de) SeqCap EZ Exome Enrichment Kit v3.0 捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)平臺以及 Agilent 公(gong)司開發的(de)(de)(de) SureSelect Human All Exon V6 捕(bu)(bu)獲(huo)(huo)平臺。
實驗策略
a) 測序平臺： Illumina Hiseq
b) 測序數據量：6-12G/個體
c) 覆蓋倍數：100-200×
d) 捕獲試(shi)劑盒：SeqCap EZ Exome Enrichment Kit v3.0或SureSelect Human All Exon V6
文章發表
近幾年，外顯子組測序技術的相關研究成果的文章發表數量呈現逐年上升的趨勢，見圖。文章發表的雜志包括Nature Genetics (IF 29.352), Gastroenterology (IF 16.716), The American Journal of Human Genetics (IF 10.931), Oncotarget (IF 6.359)等。
參考文獻
1. Dulak A M, Stojanov P, Peng S, et al. Exome and whole genome sequencing of esophageal adenocarcinoma identifies recurrent driver events and mutational complexity[J]. Nature Genetics, 2013, 45(5):478-86.
2. Robles A I, Traverso G, Zhang M, et al. Whole-exome Sequencing analyses of Inflammatory Bowel Disease-associated Colorectal Cancers[J]. Gastroenterology, 2016, 150(4):931-943.
3. Lixing Yang, Mi-Sook Lee, Hengyu Lu, et al. Analyzing Somatic Genome Rearrangements in Human Cancers by Using Whole-Exome Sequencing[J]. The American Journal of Human Genetics, 2016, 98(5):843-856.
4. Kalaora S, Barnea E, Merhavishoham E, et al. Use of HLA peptidomics and whole exome sequencing to identify human immunogenic neo-antigens.[J]. Oncotarget, 2016.
