2016-06-01
【引言】
小編(bian)在剛接觸三(san)代測(ce)序(xu)(xu)時(shi)，深(shen)(shen)(shen)深(shen)(shen)(shen)地被它的超長(chang)讀(du)(du)長(chang)所吸引(yin)，非常興奮(fen)。這(zhe)種(zhong)興奮(fen)沒(mei)持續多久，原(yuan)因是小編(bian)是一(yi)個技(ji)術控，大腦中馬上跳出一(yi)連(lian)串的疑(yi)問（相信(xin)各位讀(du)(du)者也(ye)存在類似(si)的疑(yi)問）：三(san)代測(ce)序(xu)(xu)的單堿基準確率(lv)很低(di)，用這(zhe)么低(di)準確率(lv)的數據進行拼(pin)(pin)接拿到的結果(guo)靠不(bu)靠譜(pu)？三(san)代測(ce)序(xu)(xu)的拼(pin)(pin)接算法不(bu)成熟，我(wo)拿到三(san)代數據怎么拼(pin)(pin)？三(san)代測(ce)序(xu)(xu)的成本很高(gao)，我(wo)能(neng)承(cheng)受(shou)得(de)起嗎？后來(lai)，隨著小編(bian)對(dui)三(san)代測(ce)序(xu)(xu)的深(shen)(shen)(shen)入了解，發現我(wo)擔憂的這(zhe)些都不(bu)是事！不(bu)是事！不(bu)是事！
接下來，小編就來給大家普及一下三代測序(xu)的基本知識。
【何為(wei)三代測序？】
三代測(ce)序(xu)又稱單(dan)分子實時測(ce)序(xu)技(ji)術（Single Molecule Real-Time sequencing，SMRT），是指對 DNA 分子進行測(ce)序時，不需要經(jing)過(guo)擴增，實現對(dui)每(mei)一條 DNA 分(fen)子(zi)進行單獨(du)測序(xu)的(de)技(ji)術。
【三代測序的(de)技術陣營？】
三代測(ce)序根據其技(ji)術原理主要(yao)分為(wei)兩(liang)大陣營，基(ji)于單分子(zi)熒(ying)光信(xin)號(hao)及基(ji)于納(na)米孔電流信(xin)號(hao)進行測(ce)序，代表公司分別為(wei) Pacific Biosciences 和(he)Oxford Nanopore。目前，Pacific Biosciences 公司推出的(de)三代(dai)測序儀在國內(nei)市場接(jie)受(shou)度和(he)應用廣泛(fan)。
【PacBio 為何能實現單分子(zi)超長測序？】
PacBio的單(dan)分子超長(chang)(chang)讀長(chang)(chang)主(zhu)要(yao)歸功于兩(liang)項重大發明(ming)專利技術：
其一：零模波導孔技(ji)術（Zero-Mode Waveguides，ZMWs）。該專利的(de)設計靈感來自于微波爐門(men)，簡單來說就是設計一個孔徑非(fei)常(chang)小的(de)納(na)米(mi)孔，光(guang)僅能照(zhao)亮固(gu)定了(le)單個 DNA 聚合酶/模板分子(zi)的納米孔底部。該發明專利能.大限度地降低背景(jing)熒(ying)(ying)光(guang)信號(hao)噪音(yin)，使單分子(zi)的熒(ying)(ying)光(guang)信號(hao)檢測成為(wei)可能；
其二：核苷(gan)酸標記(ji)方(fang)法。傳統的一(yi)代、二代測序均是將熒光標記(ji)連接(jie)到(dao)核苷(gan)酸的堿基上，也就(jiu)是摻(chan)入到(dao) DNA 鏈中。這些大分子的熒光染料影響(xiang) DNA 聚合酶(mei)的活性(xing)，造成聚合反應的提前(qian)終止。PacBio 的熒光(guang)(guang)標記(ji)連接(jie)到核苷酸(suan)的磷酸(suan)基團，熒光(guang)(guang)標記(ji)會隨(sui)著 DNA 鏈的延伸而(er)自動脫落，所形成的 DNA 分(fen)子為天然的 DNA 鏈(lian)。
【PacBio 測序平臺？】
PacBio 公司推出的(de)三代測序平(ping)臺主要有兩大系列，即(ji) RS 系(xi)列和 Sequel 系(xi)列(lie)。其(qi)中(zhong)，RS II 系(xi)列于(yu)2013年(nian)4月份(fen)推(tui)出，通量為 500 Mb ~ 1 Gb /SMRT Cell；Sequel 系列于2015年(nian)9月份(fen)推(tui)出，該系(xi)列與 RS II 系列(lie)測序原理相(xiang)同，但(dan)測序通量(liang)有(you)了很大(da)的提升，單(dan)個 SMRT Cell 的測序通(tong)量為 RS II 系列的 7 倍。目前，國(guo)內(nei)應用.為廣泛(fan)的仍然是(shi) RS II 系列。但是，據小編所知，很多公司(si)都在積極引進(jin) Sequel 測(ce)序(xu)系統，國內(nei)訂購的 Sequel 系統數量已經接近 10臺。小(xiao)編所在的(de)公司派森諾生(sheng)物也已經訂購了一臺 Sequel，該(gai)平(ping)臺預(yu)計會在(zai) 5 月份(fen)發貨，6月份進行裝機。
【PacBio 測序優(you)勢？】
1、超長讀(du)長，平均 Reads 長度超過 20 kb，.長(chang)讀長(chang)超過 60 kb；
2、無需經過擴增，避免測序覆(fu)蓋的不均一性(xing)；
3、無(wu) GC 偏好(hao)性；
4、測序速度快，單個(ge) SMRT Cell 的(de)運行時間(jian)為 2~6 hr；
5、直(zhi)接獲得(de)堿基的修飾(shi)信(xin)息，如甲基化修飾(shi)；
6、一致性準確率高(gao)，30× 的測序深度(du)拼接得到的單(dan)堿(jian)基一致性準確(que)率(lv)可達到99.999%。
【PacBio 測序模式及其應用(yong)？】
三代(dai)測序(xu)模(mo)式主要有(you)兩種，即標準模(mo)式和環形一致性測序(xu)模(mo)式（circular-consensus sequence，CCS），這兩種模式的(de)目的(de)及應用范圍均(jun)不同。
標準(zhun)測(ce)序(xu)模式的主要(yao)(yao)目的是為(wei)了獲得長片段序(xu)列，主要(yao)(yao)應用于基因(yin)組(zu)從(cong)頭(tou)測(ce)序(xu)、全(quan)長轉錄本測(ce)序(xu)等；
CCS測序模式的主要目的是為了獲得(de)稀有(you)突變信(xin)息(xi)，主要應用于16S 宏基因組測序、低頻率(lv)的異(yi)質(zhi)性序列獲取等等。
