2016-06-01
隨著(zhu)三代測序(xu)技(ji)術的(de)成熟(shu)，得到了越來越多(duo)的(de)科研(yan)工作(zuo)者(zhe)的(de)認可(ke)。關于(yu)三代測序(xu)的(de)文(wen)章(zhang)(zhang)數量，近年來不(bu)斷地增長，很多(duo)發表在SCI的(de)期刊上，比如利用(yong)三代測序(xu)技(ji)術開展轉(zhuan)錄組(zu)(zu)測序(xu)，可(ke)獲得mRNA的(de)全長信息和(he)基(ji)因(yin)結構信息，這類研(yan)究的(de)文(wen)章(zhang)(zhang)影響(xiang)因(yin)子基(ji)本是10分(fen)以上。說到這里(li)，各位老師、學者(zhe)們(men)是不(bu)是已(yi)經按耐不(bu)住了呢？今(jin)天(tian)小編(bian)就三代轉(zhuan)錄組(zu)(zu)測序(xu)的(de)技(ji)術原(yuan)理帶(dai)領(ling)大家縱觀全長轉(zhuan)錄組(zu)(zu)的(de)時代！三代測(ce)(ce)序(xu)(xu)又(you)稱單分子實時測(ce)(ce)序(xu)(xu)技(ji)術(shu)（Single Molecule Real-Time sequencing，SMRT），是指對(dui) DNA 分子進(jin)行測(ce)(ce)序(xu)(xu)時，不需要經過擴增，實現對(dui)每一(yi)條 DNA 分子進(jin)行單獨(du)測(ce)(ce)序(xu)(xu)的技(ji)術(shu)。將三代測(ce)(ce)序(xu)(xu)應用在轉錄組測(ce)(ce)序(xu)(xu)中，可以真實反映(ying)動植物基因(yin)組(zu)(zu)結構信息，獲得全長轉(zhuan)錄組(zu)(zu)。眾(zhong)所周知，應用二(er)(er)代轉(zhuan)錄組(zu)(zu)測序(xu)技(ji)術(shu)，無(wu)論(lun)是(shi)有參考(kao)基因(yin)組(zu)(zu)還是(shi)無(wu)參考(kao)基因(yin)組(zu)(zu)，都需(xu)要拼接(jie)成一個(ge)完整的轉(zhuan)錄本，那(nei)么問題來(lai)了，二(er)(er)代測序(xu)下機的都是(shi)短(duan)片段，要得到原始的轉(zhuan)錄本信息，就(jiu)需(xu)要對短(duan)片段進行拼接(jie)。通過PacBio所(suo)獨有(you)的(de)環形一致性(xing)測(ce)序(xu)(xu)（Circular-consensus sequence，CCS）模式，可以(yi)(yi)極大地提(ti)高測(ce)序(xu)(xu)的(de)準(zhun)確(que)率，一般而(er)言(yan)，將序(xu)(xu)列循環測(ce)序(xu)(xu)5~6次后，獲得的(de)一致性(xing)序(xu)(xu)列的(de)準(zhun)確(que)率可以(yi)(yi)達(da)到(dao)99.99%（QV40）以(yi)(yi)上，遠遠超過了二代測(ce)序(xu)(xu)的(de)準(zhun)確(que)率。
【平臺較量】
加利福尼亞太平(ping)洋生物科學公(gong)司(si)（Pacific Biosciences of California, Inc., PacBio）推(tui)出(chu)的(de)三(san)代測(ce)(ce)序平(ping)臺(tai)主(zhu)要(yao)有(you)兩大(da)系(xi)(xi)列(lie)，即 RS 系(xi)(xi)列(lie)和 Sequel 系(xi)(xi)列(lie)。其中(zhong)，RS II 系(xi)(xi)列(lie)于(yu)2013年(nian)4月份(fen)推(tui)出(chu)，通量(liang)為 500 Mb ~ 1 Gb /SMRT Cell；Sequel 系(xi)(xi)列(lie)于(yu)2015年(nian)9月份(fen)推(tui)出(chu)，該系(xi)(xi)列(lie)與(yu) RS II 系(xi)(xi)列(lie)測(ce)(ce)序原理相同，但(dan)測(ce)(ce)序通量(liang)有(you)了(le)很(hen)大(da)的(de)提升(sheng)，單個 SMRT Cell 的(de)測(ce)(ce)序通量(liang)為 RS II 系(xi)(xi)列(lie)的(de) 7 倍(bei)。目(mu)前，國內應(ying)用(yong)廣泛的(de)仍然是 RS II 系(xi)(xi)列(lie)。但(dan)是小編所在的(de)公(gong)司(si)派(pai)森諾生物已經訂(ding)購了(le)一臺(tai) Sequel。以(yi)下表格就是兩大(da)系(xi)(xi)列(lie)的(de)對比：
【二代(dai)、三代(dai)建庫流(liu)程較量】
而對于建庫來說三代(dai)也比二(er)代(dai)的(de)建庫分外(wai)簡單，具體流程對比如下圖所示(shi)：
圖(tu)1 三(san)代(dai)轉錄組測(ce)序(xu)建庫流程
圖2 二代轉錄組測(ce)序建庫流程
從建庫(ku)流程我們(men)也可(ke)以(yi)看到(dao)，無需磁珠富集mRNA，三(san)代轉錄組測序只要用(yong)隨(sui)機引物將RNA樣品進(jin)行反轉錄形成(cheng)cDNA，再通過將cDNA跑E膠選擇目的(de)片度（如3K-5K），切膠回收后再進(jin)行一輪擴增、加環(huan)狀接頭(tou)后形成(cheng)CCS，即可(ke)上(shang)機。（其中環(huan)狀接頭(tou)序列(lie)為
5’ – pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT – 3’ ：前面(mian)(mian)綠色(se)(se)和后面(mian)(mian)藍色(se)(se)反(fan)向互補，形(xing)成(cheng)(cheng)配對，中間序(xu)列(lie)成(cheng)(cheng)環，整個(ge)(ge)形(xing)成(cheng)(cheng)發卡(ka)結構。）一個(ge)(ge)文(wen)庫(ku)對應一個(ge)(ge)SMRT Cell，單個(ge)(ge) SMRT Cell 的運行時間為 2~6 h，每(mei)個(ge)(ge)SMRT Cell有15萬個(ge)(ge)零模波導孔（ZMWs），不(bu)同(tong)片(pian)(pian)段長度的文(wen)庫(ku)進(jin)入孔的效率不(bu)同(tong)，一般小片(pian)(pian)段文(wen)庫(ku)進(jin)入孔的效率高；由于(yu)三代(dai)測(ce)序(xu)過程中無需(xu)擴增(zeng)，因而避免了(le)測(ce)序(xu)覆蓋的不(bu)均一性(xing)，也沒有GC 偏好性(xing)。
【全長轉錄組測序小結】
綜上(shang)所述，基于三代測序平臺RS II 和Sequel，技(ji)術上我們省時(shi)又省力，不(bu)論是RNA的(de)(de)(de)(de)總量（≥1μg）還是建(jian)庫(ku)步驟，較二代(dai)(dai)的(de)(de)(de)(de)測(ce)序(xu)的(de)(de)(de)(de)流程都(dou)簡明了很多；其(qi)次，我們可以得到轉錄組(zu)目標片段的(de)(de)(de)(de)全(quan)長(chang)以及轉錄本的(de)(de)(de)(de)表達量等信息，解決了擴增cDNA序(xu)列3‘或5’端的(de)(de)(de)(de)技(ji)術難題。目前(qian)關于三(san)代(dai)(dai)測(ce)序(xu)的(de)(de)(de)(de)文章數量不(bu)斷地增長(chang)，連(lian)同二代(dai)(dai)測(ce)序(xu)一(yi)起研究(jiu)的(de)(de)(de)(de)文章也(ye)是不(bu)勝枚舉，下一(yi)期(qi)我們就針對具體的(de)(de)(de)(de)文獻，結(jie)合三(san)代(dai)(dai)的(de)(de)(de)(de)分(fen)析再(zai)跟(gen)大(da)家一(yi)起分(fen)享！
