2017-12-20
簡介
OsABF1是bZIP轉錄(lu)因(yin)(yin)(yin)子(zi)，使用雜合(he)轉錄(lu)因(yin)(yin)(yin)子(zi)（HTF）的(de)(de)方法與轉錄(lu)因(yin)(yin)(yin)子(zi)激活劑VP64（ABF1V）或轉錄(lu)因(yin)(yin)(yin)子(zi)抑制劑4EAR（ABF1E）融合(he)，過(guo)表達轉基因(yin)(yin)(yin)株系顯示出明顯不同的(de)(de)耐(nai)旱(han)(han)表型。通過(guo)對轉基因(yin)(yin)(yin)水稻品系進(jin)行染色質免疫(yi)沉淀(dian)測(ce)(ce)序（ChIP-seq）和(he)(he)RNA測(ce)(ce)序（RNA-seq）測(ce)(ce)定，確(que)定OsABF1與含有(you)ACGT核心基序的(de)(de)DNA序列結合(he)。經過(guo)分(fen)析RNA測(ce)(ce)序和(he)(he)染色質免疫(yi)沉淀(dian)測(ce)(ce)序數據(ju)之間的(de)(de)重疊，鑒定了涉及干旱(han)(han)反應多個方面(mian)的(de)(de)242個OsABF1靶基因(yin)(yin)(yin)。過(guo)表達這些(xie)基因(yin)(yin)(yin)之一(yi)的(de)(de)COR413-TM1（其(qi)編碼推定的(de)(de)類囊體(ti)膜蛋白(bai)）導致耐(nai)旱(han)(han)表型，沒(mei)有(you)明顯的(de)(de)副(fu)作用，在開(kai)發耐(nai)旱(han)(han)作物方面(mian)具有(you)潛在的(de)(de)效用。
ChIP-seq：2組(zu)樣本（WT植(zhi)物和ABF1V-1轉基因(yin)株系），4周齡水稻幼苗(miao)。
RNA-seq：4組(zu)樣本(ben)（WT植物(wu)、ABF1V-1和ABF1E-1轉(zhuan)基因(yin)株(zhu)系、干旱處理的WT-D），4周(zhou)齡水稻(dao)幼苗，其(qi)中WT-D組(zu)進(jin)行(xing)4小(xiao)時PEG處理。
平(ping)臺：Illumina HiSeq 2000
1.通過(guo)分析ChIP-seq數據鑒定ABF1V結合位(wei)點(dian)
鑒定(ding)了3882個定(ding)位(wei)于啟(qi)動子或CDS區(qu)域的結(jie)合(he)峰的基因，64.7％的OsABF1結(jie)合(he)位(wei)點位(wei)于啟(qi)動子區(qu)域（圖1A）。TSS距(ju)離(li)計算顯(xian)示(shi)TSS上游200bp內的締(di)合(he)位(wei)點的富集（圖1B）,對OsABF1結(jie)合(he)序(xu)列(lie)的分析(xi)檢測到ACGTG（G / T）（C / A）共有序(xu)列(lie)的過度表達（圖2C）。
圖1 ChIP-seq ABF1V結合(he)位點鑒定
2. RNA-seq的(de)差異表達分(fen)析(xi)和聚類分(fen)析(xi)熱圖
差異表達分(fen)析(xi)顯示：ABF1E株(zhu)系(xi)中(zhong)(zhong)(zhong)上(shang)(shang)調(diao)(diao)和(he)下(xia)(xia)調(diao)(diao)基因的(de)數(shu)目分(fen)別(bie)是171和(he)818，ABF1V株(zhu)系(xi)中(zhong)(zhong)(zhong)上(shang)(shang)調(diao)(diao)和(he)下(xia)(xia)調(diao)(diao)基因的(de)數(shu)目分(fen)別(bie)是1550和(he)2255，WT-D中(zhong)(zhong)(zhong)上(shang)(shang)調(diao)(diao)和(he)下(xia)(xia)調(diao)(diao)基因的(de)數(shu)目分(fen)別(bie)是3596和(he)4089。為了找到與(yu)(yu)OsABF1 HTF轉基因系(xi)的(de)異常表型相(xiang)關的(de)基因，將(jiang)DEG分(fen)為七組。在(zai)ABF1V株(zhu)系(xi)的(de)1550個上(shang)(shang)調(diao)(diao)基因中(zhong)(zhong)(zhong)，117個在(zai)ABF1E株(zhu)系(xi)中(zhong)(zhong)(zhong)下(xia)(xia)調(diao)(diao)；在(zai)WT-D中(zhong)(zhong)(zhong)，這117個基因中(zhong)(zhong)(zhong)超過75％也被(bei)上(shang)(shang)調(diao)(diao)。聚類分(fen)析(xi)表明ABF1E株(zhu)系(xi)與(yu)(yu)WT分(fen)在(zai)一個組，但是ABF1V株(zhu)系(xi)更接近WT-D。
圖2 RNA-seq差異表達分析熱圖
圖3 RNA-seq聚類分析熱圖
3. RNA-seq和ChIP-seq數(shu)據(ju)之間的Venn圖重疊分(fen)析(xi)
ChIP-seq得(de)到的(de)與ABF1V 關(guan)聯的(de)3882個(ge)基因，通過Venn圖重疊分析發(fa)現在(zai)ABF1V株(zhu)系和WT-D中有(you)242個(ge)OsABF1結合基因被(bei)上調。這些(xie)基因被(bei)認為是(shi)OsABF1直接調控干旱脅迫下(xia)的(de)候選靶基因。
圖4 RNA-seq和ChIP-seq重(zhong)疊分(fen)析Venn圖
4. RNA-seq和ChIP-seq聚類分析及靶基因COR413-TM1的選定
聚類分析顯(xian)示與(yu)OsABF1相關(guan)而受(shou)干(gan)旱(han)脅迫影響的(de)(de)基因(yin)都(dou)豐富(fu)了在(zai)與(yu)膜(mo)，運輸，氧(yang)化還原過程(cheng)，代謝(xie)，轉錄因(yin)子活性(xing)，激酶活性(xing)，磷(lin)酸酶活性(xing)，應激反應有關(guan)的(de)(de)途徑中(zhong)。根據轉錄本(ben)與(yu)富(fu)集(ji)的(de)(de)途徑的(de)(de)關(guan)系(xi)(xi)以(yi)及qRT-PCR和(he)ChIP-qPCR，又選出(chu)了7個候(hou)選基因(yin)。這7個基因(yin)都(dou)在(zai)應激反應功能分類中(zhong)高(gao)度富(fu)集(ji)，干(gan)旱(han)條件下上調(diao)，在(zai)ABF1V株系(xi)(xi)上調(diao)，在(zai)ABF1E株系(xi)(xi)中(zhong)下調(diao)。其中(zhong)一個候(hou)選基因(yin)是OR413-TM1，被確認是OsABF1的(de)(de)直接靶基因(yin)，且(qie)其超表達實驗表現出(chu)耐旱(han)表型(xing)。
圖5 RNA-seq和ChIP-seq聚類分析圖
參考(kao)文(wen)獻：
Zhang C,Li C, Liu J,Lv Y,Yu C,Li H,Zhao T,Liu B. The OsABF1 transcription factor improves drought tolerance by activating the transcription ofCOR413-TM1 in rice.J Exp Bot. 2017 Jul 20;68(16):4695-4707.
