2018-01-17
期刊：Developmental and Comparative Immunology
影(ying)響因子(zi)：3.217
ROS（reactive oxygen species,ROS）是需氧(yang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在代謝過(guo)(guo)程中(zhong)產生的(de)一系列活(huo)性(xing)氧(yang)簇。中(zhong)、高(gao)濃度的(de)ROS通過(guo)(guo)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)氧(yang)化應(ying)激反應(ying)誘導(dao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡(wang)甚至導(dao)致(zhi)其壞死。隨著自(zi)(zi)由基(ji)生物學研究(jiu)的(de)發展，研究(jiu)者們逐(zhu)漸認(ren)識到ROS 可雙(shuang)向調控(kong)某(mou)些腫瘤細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)凋亡(wang)和增殖，并發現了自(zi)(zi)由基(ji)與細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)信號(hao)轉(zhuan)導(dao)之間(jian)的(de)內在關聯。它能(neng)使造(zao)血(xue)(xue)祖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分化，并在造(zao)血(xue)(xue)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)命運調控(kong)中(zhong)發揮著重要的(de)作用(yong)。在此篇(pian)文章(zhang)的(de)研究(jiu)中(zhong)，利用(yong)離子激流(liu)質(zhi)子測序(xu)平臺(tai)（Ion Torrent Proton sequencing platform），對中(zhong)華絨(rong)螯蟹的(de)造(zao)血(xue)(xue)組織(zhi)（HPT）和血(xue)(xue)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)進行了轉(zhuan)錄(lu)組測序(xu)，尋找與造(zao)血(xue)(xue)功能(neng)相關的(de)潛在的(de)信號(hao)通路；篩查成熟(shu)血(xue)(xue)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)潛在的(de)分子標記以及挖掘ROS在造(zao)血(xue)(xue)功能(neng)中(zhong)的(de)作用(yong)、分子基(ji)礎(chu)和調節機(ji)制。
實(shi)驗對象：中華(hua)絨螯蟹(xie)
實驗方法：
1) 對HTP和(he)血細胞(bao)進行轉錄組(zu)測序和(he)QPCR驗證
2) 對HTP和血細胞中的ROS進行測(ce)定
3) 對HTP細(xi)胞(bao)的(de)吞噬能力進(jin)行(xing)流式檢測
4) 注(zhu)射NAC和(he)嗜水(shui)氣單(dan)胞(bao)菌后測定ROS和(he)血細胞(bao)總數（THC）
實驗結(jie)果：
1. 通過對HTP和血細胞(bao)中的ROS比(bi)較和對HTP細胞(bao)的吞(tun)噬能力的研究，探索ROS在HTP細胞(bao)增殖和分(fen)化過程中的作用(yong)
圖1 ROS和吞(tun)噬作用的(de)流式(shi)檢(jian)測結(jie)果
氧(yang)化還原系統在(zai)(zai)維(wei)持干(gan)細(xi)胞(bao)的(de)自我更新和(he)分化方面起著重(zhong)要的(de)作用(yong)(yong)。活(huo)性氧(yang)(ROS)是由氧(yang)代謝(xie)產生的(de)，在(zai)(zai)許多(duo)過(guo)程中，如癌癥、心(xin)血(xue)(xue)管疾病和(he)衰老，都(dou)被(bei)牽(qian)涉其中。越(yue)來越(yue)多(duo)的(de)研(yan)究揭示了(le)(le)ROS在(zai)(zai)血(xue)(xue)液生成中重(zhong)要的(de)調節作用(yong)(yong)。HPT和(he)血(xue)(xue)細(xi)胞(bao)中通過(guo)流式細(xi)胞(bao)儀均檢測(ce)到ROS陽(yang)性信號(hao)，但是HPT中ROS的(de)陽(yang)性率明顯高于(yu)血(xue)(xue)細(xi)胞(bao)（如圖(tu)1A和(he)1C）。HPT細(xi)胞(bao)對于(yu)直徑為2μm的(de)乳膠微球的(de)吞(tun)噬(shi)能力為8.2%（如圖(tu)1B）。HPT細(xi)胞(bao)具有吞(tun)噬(shi)細(xi)胞(bao)的(de)能力被(bei)證明，這表明在(zai)(zai)成熟前，血(xue)(xue)細(xi)胞(bao)前體(ti)細(xi)胞(bao)可能發(fa)生了(le)(le)功能性分化。
2. 通過(guo)對HPT和血細胞轉(zhuan)錄組數據比較，研究(jiu)血細胞生成機制(zhi)和開發(fa)潛在的分子(zi)標(biao)記物
表1 轉(zhuan)錄組測序比對統計
表(biao)2 兩組中(zhong)差異表(biao)達基(ji)因數目統計
圖2 HPT和血細胞GO注釋
圖3 差異(yi)表達(da)基因富集分析
對HPT和血細胞進行轉錄組測序，得到如表1和表2所示數據。對測序后的數據進行GO注釋（圖2）HPT和血細胞比較，共有362個差異表達基因（圖3），其中301個在HPT中上調，61個在血細胞中上調。 這三(san)百六十(shi)二種不(bu)同表達的基因，其(qi)中一(yi)些可能是HPT和血(xue)細胞的標志(zhi)性分子(zi)。301個在HPT中上調的基因成功富集到50個KEGG信號通路上，例如嘌呤代謝，嘧啶代謝，賴氨酸生物合成，組氨酸代謝，花生四酸代謝，脂肪酸生物合成，檸檬酸循環(TCA循環)和氧化磷酸化等。61個在血細胞中上調的基因主要富集到了七個KEGG通路，其中一個是酪氨酸代謝途徑，這表明了在血細胞中有獨特的酚氧化酶激活系統。此次的轉錄組數據為進一步研究血細胞生成機制和開發潛在的分子標記物提供了資源。
圖4 HPT和血細胞32個差異表達基(ji)因QPCR分析
如圖4所(suo)示，HPT和血細胞32個差異表達(da)基因(yin)可分(fen)為DNA、RNA和蛋(dan)白合成，細胞分(fen)裂(lie)，線粒體和能量代謝，酚氧化酶(mei)激活系統和其他五類。這(zhe)一結果(guo)也符合造血干細胞在分(fen)裂(lie)和分(fen)化過(guo)程中需要大量的DNA、RNA和蛋(dan)白質。對這(zhe)些基因(yin)進行QPCR驗證，結果(guo)和轉錄組(zu)測(ce)序結果(guo)一致。
3. 通過注射NAC探(tan)究ROS對HPT造血功(gong)能的影響
NAC是一(yi)種ROS清除(chu)劑(ji)，在NAC刺激12h和24h后，HPT細胞中(zhong)ROS的含量等級明顯下(xia)降(jiang)(jiang)（圖(tu)5A）。使用CCK8方法檢測NAC注(zhu)射(she)24h后HPT細胞的細胞活力，圖(tu)5B中(zhong)明顯可以(yi)看出NAC組細胞活力顯著(zhu)下(xia)降(jiang)(jiang)，并且圖(tu)5C中(zhong)可以(yi)看出注(zhu)射(she)NAC12h和24h后，血(xue)細胞總數明顯下(xia)降(jiang)(jiang),表(biao)明NAC抑制HPT細胞增殖。
圖5 NAC對HPT細胞中ROS、細胞活力和THC的影(ying)響
圖6 注射生理鹽水，嗜水氣(qi)單(dan)胞(bao)菌以及嗜水氣(qi)單(dan)胞(bao)菌和NAC對(dui)THC的影響(xiang)
為了(le)進一(yi)步證(zheng)明ROS和造(zao)血功(gong)能之間(jian)的(de)(de)關系，對120只中(zhong)華絨螯蟹隨機分成3組，第一(yi)組注(zhu)射生理鹽水，第二組注(zhu)射嗜水氣(qi)單胞(bao)(bao)菌(jun)(jun)，第三組注(zhu)射嗜水氣(qi)單胞(bao)(bao)菌(jun)(jun)和NAC，然后統計(ji)THC的(de)(de)值。圖6表明注(zhu)射NAC可(ke)(ke)以(yi)抵消注(zhu)射嗜水氣(qi)單胞(bao)(bao)菌(jun)(jun)導致的(de)(de)THC增(zeng)加的(de)(de)效果(guo)，使其恢復(fu)正常(chang)值。總結就(jiu)是(shi)：經(jing)NAC對ROS進行了(le)清(qing)除后，HPT細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)相對存活能力顯著降(jiang)低(di)，同時，紅(hong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)總數(shu)也減(jian)少。更重(zhong)要(yao)的(de)(de)是(shi)，NAC可(ke)(ke)以(yi)顯著降(jiang)低(di)由細(xi)(xi)菌(jun)(jun)刺激(ji)引起的(de)(de)血細(xi)(xi)胞(bao)(bao)總數(shu)的(de)(de)增(zeng)加。這(zhe)些(xie)結果(guo)共同證(zheng)明了(le)ROS信號對血細(xi)(xi)胞(bao)(bao)釋(shi)放的(de)(de)重(zhong)要(yao)性(xing)。
參考文獻：
Jia, Z., Wang, M., Wang, X., Wang, L., Qiu, L., & Song, L. Transcriptome sequencing reveals the involvement of reactive oxygen species in the hematopoiesis from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis. Developmental & Comparative Immunology. doi: //doi.org/10.1016/j.dci.2017.12.030
