2018-01-31
番茄（Solanum lycopersicum）是研究果實生物學的既定模型；然而，大多數對番茄果實生長和成熟的研究都是基于均質果皮，而不考慮個體細胞和組織類型的內部組織或表達特征。使用激光顯微切割（LM）或手分離和RNA-Seq分析，作者提出了一個番茄果子個體發生學上的時空解決轉錄組分析。監管和結構基因網絡，包括轉錄因子家族和激素合成和信號傳導途徑，定義在組織和發育光譜。成熟程序揭示為包括基因表達的梯度，在內部組織中開始然后向外輻射，并沿著緯度軸向基本上。作者還確定了疊加在成熟梯度上的表觀遺傳控制模式的空間變化。功能研究闡明了先前掩蓋的調控現象和關系，包括與果實品質性狀（如質地，顏色，香氣和代謝物特征）相關的現象。
實驗材料：在開花(hua)期（DPA）受(shou)精后(hou)的(de)5，10，20或(huo)30天(tian)(tian)時收獲膨脹的(de)果(guo)(guo)(guo)實。成熟期和成熟的(de)果(guo)(guo)(guo)實MG階段(duan)（全尺寸綠色(se)(se)(se)(se)果(guo)(guo)(guo)實，約(yue)39 DPA），Br階段(duan)（約(yue)42 DPA，確定打(da)破從綠色(se)(se)(se)(se)到黃(huang)褐色(se)(se)(se)(se)，表(biao)面少(shao)于10％），Pk階段(duan)（50％粉紅(hong)(hong)(hong)色(se)(se)(se)(se)或(huo)紅(hong)(hong)(hong)色(se)(se)(se)(se)，大(da)約(yue)Br + 2天(tian)(tian)），淡紅(hong)(hong)(hong)色(se)(se)(se)(se)（LR）階段(duan)（100％光照）紅(hong)(hong)(hong)色(se)(se)(se)(se)，約(yue)Br + 4天(tian)(tian)），紅(hong)(hong)(hong)色(se)(se)(se)(se)成熟（RR）階段(duan)（約(yue)Br+8天(tian)(tian)全紅(hong)(hong)(hong)）。每天(tian)(tian)在同一(yi)時間從60個(ge)隨機(ji)選擇的(de)單株上收集子(zi)房和果(guo)(guo)(guo)實樣品。通過使用激(ji)光顯微切割（LM）或(huo)手分(fen)(fen)離的(de)方法(fa)獲得(de)六個(ge)主要的(de)果(guo)(guo)(guo)實組織(zhi)(zhi)，包括果(guo)(guo)(guo)皮，隔膜，周圍組織(zhi)(zhi)，胎(tai)盤，小柱，以及種子(zi)（這(zhe)里(li)分(fen)(fen)類為(wei)組織(zhi)(zhi)型）。
測序平臺：Illumina HiSeq2500
基于組織或細胞類型的發育中番茄果實的RNA-Seq。
通過(guo)來自六種主要果(guo)實(shi)組(zu)織(zhi)(zhi)（圖1a）和五種果(guo)皮細(xi)胞/組(zu)織(zhi)(zhi)類型的LM衍生的或(huo)手工解剖的樣品的RNA測序（RNA-Seq）產生轉錄組(zu)數據，共同(tong)跨越10個發育階段的果(guo)實(shi)赤道(dao)地區（圖1c）。果(guo)實(shi)組(zu)織(zhi)(zhi)在早熟(shu)和早熟(shu)期也分(fen)離自不同(tong)的緯度部分(fen)：在后者(zhe)中，果(guo)皮端部的果(guo)皮中可觀察到(dao)與成(cheng)熟(shu)相關的顏色(se)變化(hua)（圖1d）。
圖1 進行RNA測序的番(fan)茄組織及細胞材料
對來自總共(gong)483個(ge)樣品的(de)RNA-Seq數據進行總結(jie)。在(zai)(zai)(zai)6個(ge)果(guo)(guo)(guo)(guo)實組(zu)織(zhi)和(he)5個(ge)果(guo)(guo)(guo)(guo)皮LM樣品中(zhong)，在(zai)(zai)(zai)發育過(guo)程(cheng)中(zhong)的(de)某一點至少(shao)(shao)有一種(zhong)組(zu)織(zhi)/細(xi)胞(bao)類型(xing)分別(bie)表達(da)了24506和(he)20732個(ge)基(ji)(ji)因(yin)（平(ping)均(jun)RPM≥1），但通常在(zai)(zai)(zai)果(guo)(guo)(guo)(guo)實膨大期(qi)間檢(jian)測(ce)到更(geng)多（圖2），幾乎(hu)一半的(de)基(ji)(ji)因(yin)在(zai)(zai)(zai)六種(zhong)果(guo)(guo)(guo)(guo)實組(zu)織(zhi)（10328個(ge)基(ji)(ji)因(yin)；42％）或(huo)五種(zhong)果(guo)(guo)(guo)(guo)皮細(xi)胞(bao)/組(zu)織(zhi)類型(xing)（9842基(ji)(ji)因(yin)；47％）。相反，相對較少(shao)(shao)的(de)基(ji)(ji)因(yin)在(zai)(zai)(zai)整個(ge)發育過(guo)程(cheng)中(zhong)表現出組(zu)織(zhi)/細(xi)胞(bao)特(te)異性表達(da)：在(zai)(zai)(zai)組(zu)織(zhi)樣品中(zhong)的(de)最大亞組(zu)（1189；4.9％）和(he)果(guo)(guo)(guo)(guo)皮細(xi)胞(bao)/組(zu)織(zhi)類型(xing)中(zhong)的(de)維管組(zu)織(zhi)中(zhong)（950；4.7％）（圖3）。這(zhe)與種(zhong)子內(nei)組(zu)織(zhi)的(de)高度分化和(he)功能特(te)化以及形成(cheng)血管組(zu)織(zhi)的(de)多種(zhong)不(bu)同細(xi)胞(bao)類型(xing)一致。
圖2 果實組織/細胞(bao)類型表(biao)達基因數目
圖3 果實組織/細胞(bao)類型中(zhong)表達基因的分布
在(zai)(zai)解剖的(de)(de)(de)果(guo)皮(pi)細胞(bao)/組(zu)織樣品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)表(biao)達的(de)(de)(de)20732個基(ji)(ji)(ji)因(yin)中(zhong)(zhong)(zhong)，在(zai)(zai)總(zong)果(guo)皮(pi)樣品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)也檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)到(dao)(dao)(dao)19494個，這(zhe)意味著在(zai)(zai)總(zong)果(guo)皮(pi)樣品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)未鑒定到(dao)(dao)(dao)1238個基(ji)(ji)(ji)因(yin)（6.4％）。僅(jin)(jin)通(tong)過LM檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)到(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)這(zhe)1238個基(ji)(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)表(biao)達水平相對較(jiao)低（圖4a）。在(zai)(zai)總(zong)果(guo)皮(pi)中(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)到(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)19494個基(ji)(ji)(ji)因(yin)中(zhong)(zhong)(zhong)，總(zong)共(gong)只有5.0％（從長(chang)(chang)角骨的(de)(de)(de)0.2％到(dao)(dao)(dao)維管(guan)組(zu)織中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)2.6％）顯示細胞(bao)或(huo)組(zu)織特異性表(biao)達（圖4b）。相反，僅(jin)(jin)通(tong)過LM檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)到(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)1238個基(ji)(ji)(ji)因(yin)中(zhong)(zhong)(zhong)，64％顯示出空間特異性表(biao)達（從長(chang)(chang)角骨的(de)(de)(de)2.5％到(dao)(dao)(dao)維管(guan)組(zu)織中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)35％；圖4c）。這(zhe)些數(shu)據表(biao)明(ming)使用高分辨(bian)率轉錄組(zu)測(ce)(ce)序使我(wo)們能夠檢(jian)(jian)(jian)(jian)測(ce)(ce)在(zai)(zai)某些果(guo)皮(pi)細胞(bao)類型(xing)中(zhong)(zhong)(zhong)僅(jin)(jin)以低量存在(zai)(zai)的(de)(de)(de)轉錄物，并且在(zai)(zai)總(zong)果(guo)皮(pi)樣品(pin)中(zhong)(zhong)(zhong)過度稀釋。
RNA-Seq的(de)主成分分析（PCA）揭示了基于(yu)發(fa)育階段，對應于(yu)果實(shi)赤(chi)道地區的(de)組織或細胞(bao)類型(xing)的(de)轉錄譜(pu)的(de)清(qing)晰聚類（圖(tu)5）。
圖(tu)4 通(tong)過LM確定的基因表達譜
圖5 6種(zhong)果(guo)(guo)實(shi)組(zu)(zu)織和(he)5種(zhong)果(guo)(guo)皮(pi)組(zu)(zu)織/細胞(bao)的(de)PCA分析(xi)
高(gao)分(fen)辨率的基因(yin)(yin)共表達網絡與果實品質性狀相關(guan)的基因(yin)(yin)的高(gao)分(fen)辨率轉錄(lu)分(fen)析。
使用全局轉錄本分析的共表達分析允許識別功能相關的基因網絡，而更高級的時空數據集應該導致更嚴格定義的網絡預測。為了檢驗這個想法，作者首先使用了一種指導基因的方法，并尋找與查爾酮合成酶基因SlCHS-2共表達的基因。SlCHS-2在外表皮細胞中表現出優先表達，其在成熟開始后增加（圖6a）。在30DPA之后，在種子中也檢測到了SlCHS-2的表達（圖6b）。圖7展示了與SlCHS-2共同表達的前10個基因（SCC = 0.74-0.85）。
圖6 SlCHS-2在果皮細胞/組織類型和種子中的表達
圖7表達多維數據集展示SlCHS-2和共表達基因的表達
預(yu)測(ce)生(sheng)長素信(xin)號中的蛋(dan)白質相(xiang)互(hu)作用。
全球共表達數據也提供了一個機會來確定功能性蛋白質-蛋白質相互作用可能發生的條件，組織/細胞和發育階段。作者對不同的組織/細胞類型和發育階段進行了21個ARF和24個Aux / IAA基因的成對表達分析3738。在所有的ARF-Aux / IAA組合中，SlARF4和SlIAA15之間的相關性最高（Pearson相關系數（PCC）= 0.78）。預測并證實大家族成員SlARF4和SlIAA15蛋白之間的相互作用，說明高分辨率時空表達信息如何促進相互作用蛋白伙伴的預測和實驗驗證。
圖8 生長(chang)素信號相關的成對相關分數熱(re)圖
參(can)考文(wen)獻：
Shinozaki Y, Nicolas P, Fernandez-PozoN,et al.High-resolutionspatiotemporal transcriptome mapping of tomato fruit development and ripening.Nat Commun. 2018 Jan 25;9(1):364.
