2018-05-16
在前(qian)兩期的(de)(de)微(wei)信文章中，我(wo)(wo)們為(wei)大(da)家陸(lu)續分(fen)(fen)享了(le)BSA類型(xing)、基(ji)本(ben)原理、樣(yang)本(ben)選擇等一大(da)波干貨，相信通過(guo)這(zhe)些(xie)大(da)家也都了(le)解到BSA分(fen)(fen)析其實只是一個(ge)初定(ding)位結果，后續還有(you)大(da)量的(de)(de)驗(yan)證工作(zuo)在等著你(ni)哦(e)！不過(guo)究(jiu)竟做哪些(xie)驗(yan)證才(cai)能讓我(wo)(wo)們與一篇華(hua)麗的(de)(de)SCI更(geng)(geng)近(jin)一步呢(ni)？別著急，今天小編為(wei)大(da)家帶來(lai)兩篇精(jing)彩文章，看一看BSA的(de)(de)故(gu)事(shi)要怎么講(jiang)，才(cai)能更(geng)(geng)加栩栩如生(sheng)！（文章后附精(jing)彩點評(ping)哦(e)）
1. QTL Mapping by Whole Genome Re-sequencing and Analysis of Candidate Genes for Nitrogen Use Efficiency in Rice
研究背景
氮(dan)(dan)素(su)是影響水(shui)稻生產的(de)(de)關(guan)鍵(jian)營養元素(su)，植(zhi)(zhi)物缺氮(dan)(dan)會導致葉片黃(huang)化(hua)，植(zhi)(zhi)株矮(ai)小，糧食產量(liang)(liang)降(jiang)低(di)等問題，而氮(dan)(dan)肥使用過多又會導致嚴重的(de)(de)環(huan)境(jing)污染。培育(yu)具(ju)有(you)良好氮(dan)(dan)利用效率(lv)的(de)(de)優質(zhi)水(shui)稻品種對于(yu)農(nong)業的(de)(de)可持續發展具(ju)有(you)重要意義(yi)。研究表明，氮(dan)(dan)利用率(lv)（nitrogen use efficiency, NUE）是一個由多基(ji)因和(he)(he)微效QTLs控制的(de)(de)數量(liang)(liang)性(xing)狀。本研究旨在聯合(he)混池分析（BSA）和(he)(he)全基(ji)因組重測序法鑒(jian)定水(shui)稻NUE關(guan)鍵(jian)位點。
材料與方法：
首先，由精(jing)英(ying)水稻(dao)(dao)GH998和(he)野生稻(dao)(dao)Y11繁殖多代得(de)到近等(deng)基(ji)因(yin)系NILs（BC4F6），然后從中挑選氮利用率較(jiao)低(di)的(de)NIL-13B4與GH998（高NUE）雜交得(de)到F1，F1自交得(de)到F2代（280個），選取(qu)極(ji)端性(xing)狀的(de)個體各30個分別(bie)構(gou)建混池，測(ce)(ce)序(xu)深度30x，兩個親本分別(bie)測(ce)(ce)20x，測(ce)(ce)序(xu)平(ping)為 Illumina HiSeq2500。
研究(jiu)結果：
QTL-seq 鑒定NUE相關基因
通過計算高、低(di)NUE兩(liang)個混池(chi)的基因(yin)型頻率，利用detla SNP index法將(jiang)水稻NUE QTL位(wei)(wei)點定位(wei)(wei)到(dao)Chr6 6,099,043-8,940,631 bp之間(jian)（95%置信水平，圖1），并將(jiang)其命名為qNUE6。為了核(he)實qNUE6的有效性(xing)，通過 SSR分子標(biao)記結合樣(yang)本表型和基因(yin)分型數據(ju)，將(jiang)QTL位(wei)(wei)點定位(wei)(wei)到(dao)marker RM539和RM136之間(jian)，然后利用11對有多態性(xing)的InDel標(biao)記將(jiang)區間(jian)縮小到(dao)266.5kb。
圖1 SNP index圖
候選(xuan)基因表達與進化分(fen)析
在266.5kb的區間種共有(you)44個候選基(ji)因(yin)(yin)，其中(zhong)39個基(ji)因(yin)(yin)具有(you)較大效應的SNP和InDel支持。對其進行qRT-PCR驗(yan)證，結果顯示有(you)28個基(ji)因(yin)(yin)能夠正(zheng)常在根部和莖葉中(zhong)表達(da)，有(you)兩個基(ji)因(yin)(yin)LOC_Os06g15370和(he)LOC_Os06g15420在兩個親本中顯著差(cha)異(yi)表達(da)（圖2）。LOC_Os06g15370編碼(ma)肽轉運蛋(dan)白（PTR2），與(yu)擬南芥葉(xie)綠體亞(ya)硝酸鹽轉運蛋(dan)白AT1G68570有相(xiang)同的(de)PTR2 domain。同禾(he)本科作物(wu)進行進化分析，發現(xian)LOC_Os06g15370與(yu)GRMZM2G361652（玉米亞(ya)硝酸鹽轉運蛋(dan)白）和(he)Sb10g009530（高粱(liang)亞(ya)硝酸鹽轉運蛋(dan)白）的(de)序列(lie)相(xiang)似度分別高達(da)86.2%和(he)86.4%。
LOC_Os06g15420（OsAS2）編碼(ma)天冬氨酸合成(cheng)酶（AS），研究表明，有NH4+供給時，在擬南芥的根部(bu)組織(zhi)中(zhong)可檢測到OsAS2的表達。而LOC_Os06g15420與擬南芥基因AT5G65010 (ASN2) 序列相似度為87.5%。
圖(tu)2 候選基因在(zai)GH998和Y11中的(de)相對表(biao)達水平（1 mM NH3NO3處理48h后(hou)）
小(xiao)編點(dian)評：這篇文章遵循的(de)是典型(xing)QTL-seq套(tao)路，在初定位得到(dao)較(jiao)大(da)范圍的(de)候選區域后(hou)，通(tong)過SSR和InDel分析標記法縮(suo)小(xiao)區間，得到(dao)可接收數量的(de)候選基因后(hou)利用(yong)qRT-PCR來驗(yan)證(zheng)。這時再讓文獻、比對(dui)、結構和進(jin)化(hua)分析等手段統統上陣(zhen)，就(jiu)可以基本推測(ce)出基因功能啦！
2．Identification of the dwarf gene GmDW1 in soybean (Glycine max L.) by combining mapping by sequencing and linkage analysis
研究背(bei)景
矮生植(zhi)株因(yin)為能(neng)夠(gou)抗倒伏并且提高作物(wu)產(chan)量，是理想的育種(zhong)材料。研究(jiu)(jiu)表明，在(zai)影響株高發育的各(ge)個(ge)因(yin)素(su)中，赤霉素(su)（GA）等植(zhi)物(wu)激素(su)發揮(hui)了重要的作用(yong)。本研究(jiu)(jiu)旨(zhi)在(zai)通過混池測序和連鎖分(fen)析法對大豆突變株（dw）中的矮生基(ji)因(yin)位點進行(xing)鑒(jian)定并揭(jie)示相應的分(fen)子機(ji)制。
材料與(yu)方法：
大豆(dou)栽培(pei)品(pin)(pin)種(zhong)Zhongpin661經EMS誘變(bian)后得到矮(ai)生(sheng)(sheng)株（M3 line, DW），選擇含雜合DW位(wei)點的品(pin)(pin)系自交得到M4分離(li)群體。分別提(ti)取45個野生(sheng)(sheng)型(xing)和突變(bian)型(xing)個體構建混池，測序(xu)(xu)深度分別為50x和53x，插入片段長度為500bp，測序(xu)(xu)平臺為Illumina HiSeq 2500。根據(ju)歐式距離(li)法（ED）計算(suan)兩個混池中等位(wei)基(ji)因頻率。
研(yan)究結果(guo)：
dw 突變株的表型和遺傳學特性(xing)
成熟的(de)dw 突變株與野(ye)生(sheng)型Zp661相比，主莖(jing)高度明(ming)顯下降（40%）且葉子顏色呈現暗(an)綠色。主莖(jing)上的(de)總(zong)節(jie)數(shu)無明(ming)顯變化，但節(jie)間長度顯著下降（60%）。掃描電鏡(jing)結(jie)果顯示細胞長度縱(zong)向(xiang)下降而非細胞數(shu)目的(de)減少是導致dw植株矮(ai)小的(de)主要原(yuan)因（圖1）。
dw 突變株(zhu)(zhu)與株(zhu)(zhu)高(gao)(gao)正(zheng)常的3個大豆(dou)品種(zhong)（Zp661、JD12和Zh13）雜交，F1所(suo)有個體(ti)均(jun)表現為正(zheng)常株(zhu)(zhu)高(gao)(gao)，在F2群體(ti)中(zhong)高(gao)(gao)矮植株(zhu)(zhu)分離比全部(bu)符(fu)合3:1，這表明dw突變是由(you)隱性單基因控制的。
圖(tu)1 大豆dw突(tu)變株的表型特征
矮生突變株GA合(he)成通路受(shou)阻
植物生(sheng)長激素實驗(yan)結果顯示0-1mg/L GA3能(neng)促進dw突變(bian)(bian)株(zhu)莖間(jian)組織的延長，使突變(bian)(bian)株(zhu)表型(xing)恢復正常（圖(tu)(tu)1 a, b），而BR和IAA則沒有(you)該效(xiao)果。而當用GA合成抑制(zhi)劑(ji)—烯效(xiao)唑（Uni）處(chu)理時，野(ye)生(sheng)型(xing)與突變(bian)(bian)型(xing)相比植株(zhu)高(gao)度(du)下降(jiang)更多（圖(tu)(tu)1 c, d）。通(tong)過GC-MS測(ce)定野(ye)生(sheng)株(zhu)和突變(bian)(bian)株(zhu)的內(nei)源GA含量，發現GA1、GA4及前體(ti)GA12、GA19和GA24在野(ye)生(sheng)株(zhu)中(zhong)均可檢測(ce)到(dao)，但在突變(bian)(bian)株(zhu)中(zhong)僅能(neng)檢測(ce)到(dao)GA24（圖(tu)(tu)1 e），這表明dw突變(bian)(bian)表型(xing)的產生(sheng)與GA含量下降(jiang)相關。
圖2 突變株GA合成受阻
GmDW1基因mapping與精(jing)確(que)定位
通(tong)過與參考基(ji)因(yin)組(zu)Williams 82進(jin)行(xing)比(bi)對，在(zai)(zai)突(tu)變(bian)(bian)型(xing)和(he)(he)野生型(xing)混池中(zhong)鑒定到47,535個(ge)個(ge)高(gao)質量(liang)的(de)(de)(de) SNPs用于分(fen)析(xi)。以ED值(zhi)高(gao)于0.259作為閾值(zhi)，共得到6個(ge)可(ke)能的(de)(de)(de)候(hou)選區間（表5），其中(zhong)僅有3個(ge)區間存在(zai)(zai)非(fei)同(tong)義突(tu)變(bian)(bian)位點。同(tong)時(shi)，利用567個(ge)SSR標(biao)(biao)記通(tong)過連鎖分(fen)析(xi)將GmDW1 mapping到Chr8 6.7M區間。然后結合SSR 和(he)(he)SNP標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)分(fen)型(xing)結果縮小(xiao)到 SNP08-1和(he)(he)08-0716（SSR）之間的(de)(de)(de)460kb區域，該區域僅有2個(ge)SNP能引起(qi)外(wai)顯子區的(de)(de)(de)非(fei)同(tong)義突(tu)變(bian)(bian)，對應(ying)的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)分(fen)別是GmDW1和(he)Glyma.08G165100。功(gong)能注釋結果顯示，GmDW1編(bian)碼大豆的KS酶，推測可能是導致植(zhi)株矮小的關鍵(jian)基(ji)因。
表(biao)5 基因組(zu)混測(ce)測(ce)序mapping 矮生表(biao)型相關(guan)基因
小編(bian)點評：這篇(pian)文(wen)章在(zai)Mutmap+的(de)(de)基礎上(shang)與(yu)連鎖mapping相互結合(he)，綜合(he)兩者得(de)(de)到的(de)(de)overlap進一(yi)步(bu)分析候選區(qu)間，SSR、InDel、SNP標(biao)記無一(yi)例外(wai)，全(quan)部(bu)用(yong)于基因(yin)的(de)(de)精(jing)確定位。另外(wai)，非常(chang)值得(de)(de)一(yi)提的(de)(de)是人(ren)家的(de)(de)表(biao)型工(gong)作鑒(jian)定的(de)(de)非常(chang)全(quan)面，一(yi)點都不(bu)局限于表(biao)面，連SEM都用(yong)上(shang)了，并且深(shen)入研究了dw突變株(zhu)矮小的(de)(de)原因(yin)——赤霉(mei)素合(he)成(cheng)通路受阻。
參考文(wen)獻(xian)：
1. Yang et al. QTL Mapping by Whole Genome Re-sequencing and Analysis of Candidate Genes for Nitrogen Use Efficiency in Rice.[J] .Front Plant Sci, 2017, 8: 1634.
2. Li et al. Identification of the dwarf gene GmDW1 in soybean (Glycine max L.) by combining mapping-by-sequencing and linkage analysis.[J] .Theor. Appl. Genet., 2018, 131(5): 1001-1016.
