2017-10-25
絞(jiao)股(gu)(gu)(gu)藍是(shi)(shi)多(duo)年生匍匐(fu)草本植物，在亞洲廣(guang)泛種(zhong)植，有很多(duo)重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)藥用(yong)屬性。絞(jiao)股(gu)(gu)(gu)藍皂(zao)苷，是(shi)(shi)絞(jiao)股(gu)(gu)(gu)藍中(zhong)的(de)(de)(de)(de)主要有效(xiao)成分，已被充(chong)分研究(jiu)。考(kao)慮到絞(jiao)股(gu)(gu)(gu)藍重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)藥用(yong)功能，做絞(jiao)股(gu)(gu)(gu)藍的(de)(de)(de)(de)轉錄組信(xin)息研究(jiu)是(shi)(shi)很有必要的(de)(de)(de)(de)，有利于開展以后(hou)的(de)(de)(de)(de)轉錄調(diao)控研究(jiu)。廣(guang)西醫(yi)科大學吳耀生教(jiao)授團隊和(he)(he)上海派森(sen)諾合作，通過(guo)絞(jiao)股(gu)(gu)(gu)藍測序(xu)，總(zong)共獲(huo)得了50,654,708個unigenes。通過(guo)計算unigene的(de)(de)(de)(de)表達(da)量，并(bing)將數據(ju)和(he)(he)五(wu)個常用(yong)數據(ju)庫進(jin)行(xing)比對，獲(huo)得unigenes不同方面的(de)(de)(de)(de)注釋信(xin)息。發(fa)現DESeq分析(xi)結果中(zhong)FPS，SS和(he)(he)SE酶(mei)表現出(chu)不同的(de)(de)(de)(de)表達(da)水平。相(xiang)對于根和(he)(he)莖，葉片中(zhong)FPS，SS和(he)(he)SE的(de)(de)(de)(de)表達(da)量是(shi)(shi)最高的(de)(de)(de)(de)。本研究(jiu)通過(guo)對自然環境生長的(de)(de)(de)(de)絞(jiao)股(gu)(gu)(gu)藍進(jin)行(xing)轉錄學分析(xi)，發(fa)現unigene的(de)(de)(de)(de)表達(da)，酶(mei)的(de)(de)(de)(de)表達(da)（FPS,SS和(he)(he)SE）和(he)(he)絞(jiao)股(gu)(gu)(gu)藍皂(zao)苷的(de)(de)(de)(de)分布是(shi)(shi)一(yi)致的(de)(de)(de)(de)。
絞(jiao)(jiao)股(gu)(gu)藍(lan)(lan)的(de)主要有效(xiao)組成(cheng)(cheng)是絞(jiao)(jiao)股(gu)(gu)藍(lan)(lan)皂(zao)(zao)苷，它(ta)有多(duo)(duo)種(zhong)多(duo)(duo)樣(yang)(yang)的(de)生物(wu)活性(xing)，這可(ke)以解(jie)釋絞(jiao)(jiao)股(gu)(gu)藍(lan)(lan)為什(shen)么會(hui)在天(tian)然藥學(xue)中有廣泛應用(yong)(yong)。例如，絞(jiao)(jiao)股(gu)(gu)藍(lan)(lan)皂(zao)(zao)苷可(ke)以通(tong)過增(zeng)加胰島素降低血糖。還有其他功能應用(yong)(yong)像(xiang)抗癌，抗炎癥，抗焦慮，降血脂，保(bao)(bao)護(hu)肝細胞，神(shen)經(jing)保(bao)(bao)護(hu)和免疫(yi)保(bao)(bao)護(hu)等(deng)等(deng)。三帖(tie)合(he)成(cheng)(cheng)途徑可(ke)以分解(jie)為三個部分：1、IPP(異戊(wu)烯(xi)基焦磷(lin)酸(suan))或者(zhe)DMAPP（二甲基烯(xi)丙基焦磷(lin)酸(suan)酯(zhi)）合(he)成(cheng)(cheng)；2、鯊烯(xi)合(he)成(cheng)(cheng)和環(huan)化；3、功能化反應獲得鯊烯(xi)復合(he)物(wu)（圖1）。和人(ren)參(can)皂(zao)(zao)苷一樣(yang)(yang)，絞(jiao)(jiao)股(gu)(gu)藍(lan)(lan)皂(zao)(zao)苷在藥學(xue)和健康學(xue)中有很多(duo)(duo)重要應用(yong)(yong)。但是絞(jiao)(jiao)股(gu)(gu)藍(lan)(lan)皂(zao)(zao)苷和人(ren)參(can)皂(zao)(zao)苷相比(bi)，有更高的(de)異質性(xing)，其中有超(chao)過169種(zhong)絞(jiao)(jiao)股(gu)(gu)藍(lan)(lan)皂(zao)(zao)苷。絞(jiao)(jiao)股(gu)(gu)藍(lan)(lan)比(bi)人(ren)參(can)中的(de)三萜(tie)化合(he)物(wu)種(zhong)類高出5倍。這可(ke)能和三帖(tie)合(he)成(cheng)(cheng)途徑中的(de)基因與酶的(de)差異表達相關(guan)。
圖1 三帖(tie)合(he)成(cheng)途(tu)徑
高通量測序(xu)獲得(de)(de)352,999,296條原始reads，過濾(lv)掉(diao)接(jie)頭(tou)和低質量序(xu)列，剩余249,488,643條clean reads。組裝之(zhi)后得(de)(de)到1,119,964個contigs，總長(chang)(chang)度達249,488,543bp。將contigs拼(pin)接(jie)成(cheng)轉錄本(ben)，得(de)(de)到159,858,904個轉錄本(ben)序(xu)列。和NR數據庫比對后，獲得(de)(de)50,654,708個unigene，平(ping)均長(chang)(chang)度755bp。
用(yong)NR，GO，KEGG，eggNOG和Swiss-Port數據庫注釋unigenes。整體(ti)看來，eggNOG中(zhong)鑒(jian)定率最(zui)高，達到96.57%，KEGG中(zhong)鑒(jian)定率最(zui)低，只有8.77%。
表1 unigenes 注釋結果
統計unigene的(de)(de)(de)RPKM，做RPKM的(de)(de)(de)密(mi)(mi)度分(fen)(fen)布(bu)圖(tu)(tu)。發現(xian)中(zhong)(zhong)(zhong)等范圍表(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)(liang)的(de)(de)(de)unigenes的(de)(de)(de)AUC（曲線(xian)下(xia)面積）占絕(jue)大部(bu)分(fen)(fen)，低表(biao)(biao)達(da)(da)(da)或(huo)者高(gao)(gao)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)的(de)(de)(de)unigenes的(de)(de)(de)AUC是少部(bu)分(fen)(fen)的(de)(de)(de)（圖(tu)(tu)2）。通(tong)過(guo)(guo)密(mi)(mi)度分(fen)(fen)布(bu)圖(tu)(tu)發現(xian)，纖維(wei)根(gen)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)unigenes要(yao)比莖(jing)和(he)葉(xie)(xie)片(pian)(pian)(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)unigenes表(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)(liang)高(gao)(gao)。盡管莖(jing)和(he)葉(xie)(xie)片(pian)(pian)(pian)有相似的(de)(de)(de)unigene表(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)(liang)，莖(jing)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)(liang)稍(shao)微高(gao)(gao)于(yu)葉(xie)(xie)片(pian)(pian)(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)(liang)。另外分(fen)(fen)析編(bian)碼(ma)FPS,SS,SE和(he)β-AS（β-香樹(shu)精合成酶(mei)）的(de)(de)(de)unigenes的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)，發現(xian)這些(xie)unigenes在(zai)(zai)(zai)葉(xie)(xie)片(pian)(pian)(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)高(gao)(gao)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)，在(zai)(zai)(zai)纖維(wei)根(gen)中(zhong)(zhong)(zhong)低表(biao)(biao)達(da)(da)(da)，在(zai)(zai)(zai)莖(jing)中(zhong)(zhong)(zhong)要(yao)比纖維(wei)根(gen)中(zhong)(zhong)(zhong)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)(liang)高(gao)(gao)。編(bian)碼(ma)β-AS的(de)(de)(de)unigene在(zai)(zai)(zai)葉(xie)(xie)片(pian)(pian)(pian)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)量(liang)(liang)是纖維(wei)根(gen)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)將近125倍。通(tong)過(guo)(guo)DESeq軟件做兩(liang)兩(liang)比較分(fen)(fen)析測序數據，通(tong)過(guo)(guo)韋(wei)恩圖(tu)(tu)展現(xian)出(chu)差異表(biao)(biao)達(da)(da)(da)的(de)(de)(de)unigene的(de)(de)(de)分(fen)(fen)布(bu)情況（圖(tu)(tu)3）。
表2 樣品中(zhong)unigenes的RPKM值
表3unigenes兩兩比較上下調基因統(tong)計(ji)結果
圖(tu)2 unigenes的RPKM密度(du)分布圖(tu) 圖(tu)3差異unigenes的韋恩圖(tu)
分光(guang)光(guang)度法測定絞股藍的皂(zao)苷(gan)(gan)含(han)量分布。所有的樣品中葉片的皂(zao)苷(gan)(gan)含(han)量最(zui)高（3.189%），在莖（0.365%）或(huo)者(zhe)纖維根(gen)（0.172%）中皂(zao)苷(gan)(gan)含(han)量比較低。
表4 絞股藍中皂苷(gan)含量分布
基于KEGG通路分(fen)(fen)(fen)析，將涉及三(san)鐵合(he)成通路有關的(de)(de)(de)酶分(fen)(fen)(fen)為三(san)類：1、IPP或者DMAPP合(he)成相關的(de)(de)(de)酶；2、鯊(sha)烯(xi)合(he)成和環(huan)化(hua)相關的(de)(de)(de)酶；3、鯊(sha)烯(xi)功能(neng)化(hua)反應(ying)中的(de)(de)(de)酶。文中主要(yao)關注的(de)(de)(de)是(shi)FPS,SS和SE三(san)種酶，它們在三(san)帖合(he)成和環(huan)化(hua)中起重(zhong)要(yao)作用。首先FPS比(bi)較分(fen)(fen)(fen)析結果(guo)中，只有纖維根(gen)和葉片中的(de)(de)(de)表達(da)比(bi)較有差(cha)異。再次，SS比(bi)較分(fen)(fen)(fen)析結果(guo)中，兩組分(fen)(fen)(fen)析結果(guo)中有差(cha)異，表明葉片中的(de)(de)(de)表達(da)要(yao)高于纖維根(gen)和莖。最后，在SE比(bi)較分(fen)(fen)(fen)析結果(guo)中，葉片中的(de)(de)(de)表達(da)高于莖和纖維根(gen)，而 且纖維(wei)根中(zhong)的表達高于莖（圖4）。
圖4 FPS，SS，SE中基因(yin)的RPKM
在unigene功能注釋，RPKM表(biao)達量統計(ji)和絞(jiao)股藍(lan)含量測定之后，分析unigene表(biao)達，酶(mei)（unigene的(de)產出物）的(de)表(biao)達和絞(jiao)股藍(lan)皂(zao)苷的(de)含量分布(bu)之間的(de)關聯(lian)，發(fa)現unigene和酶(mei)的(de)表(biao)達與皂(zao)苷含量分布(bu)呈(cheng)正相關。也就是(shi)說樣本（纖維根，莖，葉片）中unigene和酶(mei)（FPS，SS和SE）的(de)表(biao)達取決(jue)于(yu)皂(zao)苷含量的(de)分布(bu)。這一結論，有(you)利于(yu)絞(jiao)股藍(lan)中其他次級代謝產物的(de)深(shen)入研究。
文獻(xian)來(lai)源(yuan)
Chen Q, Ma C, Qian J, et al. Transcriptome Sequencing of Gynostemma pentaphyllum to Identify Genes and Enzymes Involved in Triterpenoid Biosynthesis[J]. International journal of genomics, 2016.
