2018-06-08
MutMap方(fang)(fang)法(fa)作為一種特殊的(de)BSA方(fang)(fang)法(fa)，其主要思路是：用化(hua)學誘變(bian)(bian)劑EMS處理得(de)到突變(bian)(bian)體(ti)(ti)(ti)，然后(hou)用突變(bian)(bian)體(ti)(ti)(ti)植株與(yu)野生型(xing)(xing)親本雜(za)交得(de)到F2代(dai)，從F2代(dai)中(zhong)挑(tiao)選(xuan)突變(bian)(bian)表(biao)型(xing)(xing)的(de)個體(ti)(ti)(ti)進行混池測(ce)序(xu)。定位的(de)方(fang)(fang)法(fa)是將測(ce)序(xu)得(de)到的(de)reads比對到親本基(ji)因組(zu)上，計(ji)算SNP-index。突變(bian)(bian)體(ti)(ti)(ti)子代(dai)是所(suo)研究性狀(zhuang)(zhuang)突變(bian)(bian)位點的(de)純合個體(ti)(ti)(ti)，因此(ci)SNP-index = 1。而(er)(er)其他(ta)與(yu)性狀(zhuang)(zhuang)無關(guan)(guan)的(de)SNP位點，SNP-index ≈ 0.5。而(er)(er)與(yu)突變(bian)(bian)位點鄰近的(de)SNP位點，由于(yu)連(lian)鎖效(xiao)應，SNP-index也(ye)會增加，即＞0.5 ，從SNP-index圖上看(kan)則(ze)會呈(cheng)現(xian)一個峰，性狀(zhuang)(zhuang)相關(guan)(guan)候選(xuan)基(ji)因就位于(yu)該區域內。
對于(yu)上述mutmap方法基因定位(wei)過(guo)程，常見路線是(shi)對野生(sheng)型(xing)親(qin)本和(he)突(tu)變F2子代(dai)(dai)混(hun)池進行測(ce)序(xu)。實(shi)際(ji)項目(mu)中，某些情(qing)況(kuang)下(xia)，我(wo)們會推薦測(ce)野生(sheng)型(xing)子代(dai)(dai)混(hun)池。那么(me)對于(yu)野生(sheng)型(xing)F2子代(dai)(dai)混(hun)池是(shi)否有(you)必要測(ce)序(xu)，加(jia)測(ce)野生(sheng)型(xing)子代(dai)(dai)對定位(wei)結(jie)果(guo)影響如(ru)何呢(ni)？下(xia)面我(wo)們分別從理論(lun)上和(he)實(shi)際(ji)的項目(mu)結(jie)果(guo)來說明這個(ge)問(wen)題：
首先，對于EMS誘變(bian)的植株，SNP包含兩類(lei)(lei)，普通(tong)SNP和(he)誘變(bian)產生的SNP，以(yi)玉米（基(ji)因組2G）為(wei)例，兩類(lei)(lei)突(tu)變(bian)的頻率(lv)和(he)數量分別為(wei)：
* 普通SNP： 突變頻率 1x10-3 數量2M SNP
EMS誘變(bian)： 突變(bian)頻率 5x10-6 數量 10k SNP
可以看(kan)出，普(pu)通(tong)SNP比EMS誘(you)變(bian)(bian)產生的(de)(de)SNP數目要多得多，即使普(pu)通(tong)SNP有(you)1%的(de)(de)假陽性或假陰性，也會有(you)20k的(de)(de)SNP，數目也是EMS誘(you)變(bian)(bian)SNP數的(de)(de)兩倍。因(yin)此，對于mutmap類項目，這些普(pu)通(tong)的(de)(de)SNP作為與性狀無關的(de)(de)背(bei)景噪音，對定(ding)位結果的(de)(de)影響會更大(da)，我們期(qi)望的(de)(de)信號位點(dian)可能會被背(bei)景噪音所淹沒。
那么，我們如(ru)何降低(di)背景(jing)噪(zao)音(yin)的影響呢？除了(le)通過我們常規(gui)的過濾手(shou)段，保(bao)證獲得(de)的SNP的準確性和可靠(kao)性之(zhi)外，可以加(jia)測與突變(bian)體遺傳背景(jing)相(xiang)同的野(ye)生型子(zi)代混池(chi)的手(shou)段。
下面我們通過實例對于是否測野(ye)生子代池的結果做一個(ge)比較(jiao)。
研究物種：某植物
測序平臺：Illumina HiSeq
測序策略：野(ye)生親本20x ; 突變子代混池30x ; 野(ye)生型子代混池 50x
混(hun)池樣(yang)本(ben)數：100株
（A圖為(wei)突(tu)變(bian)子代(dai)混池(chi)(chi)SNPindex，B圖為(wei)野生型子代(dai)混池(chi)(chi)SNPindex，D圖為(wei)Delta-SNPindex）
我(wo)(wo)(wo)們(men)以1號和2號染(ran)色體為例，若只(zhi)測野生型親本和突(tu)(tu)變子(zi)代(dai)混池(chi)，則我(wo)(wo)(wo)們(men)只(zhi)得(de)到突(tu)(tu)變子(zi)代(dai)池(chi)的SNPindex圖，即圖A，從圖中(zhong)我(wo)(wo)(wo)們(men)可以看出有(you)多個(ge)峰，均會(hui)作為候選區域做后(hou)續分析。
若加測野(ye)生(sheng)型子代(dai)池，則會得到野(ye)生(sheng)型子代(dai)池的SNPindex，即(ji)B圖，兩者相減，可以(yi)得到Delta-SNPindex，即(ji)D圖。從結(jie)果可以(yi)看到，多個噪音峰值被(bei)消(xiao)除(chu)，最終位(wei)于2號(hao)染色體頭部(bu)的候選區域會被(bei)篩選出來。
所以(yi)，對于mutmap項目(mu)，從分析角度講，只測野(ye)(ye)生(sheng)親本和(he)子代(dai)突變混池(chi)(chi)是可(ke)以(yi)的，但(dan)會包(bao)含假陽性結果，具(ju)體影響程度與(yu)不同物(wu)(wu)種(zhong)及測序情況有(you)關。若加(jia)測野(ye)(ye)生(sheng)型子代(dai)混池(chi)(chi)會改善(shan)定位結果。對于基(ji)因組(zu)比較大、比較復雜的物(wu)(wu)種(zhong)，推薦(jian)大家加(jia)測野(ye)(ye)生(sheng)型突變混池(chi)(chi)。
