2018-09-11
我(wo)們(men)在(zai)前期(qi)通過(guo)一(yi)篇研究(jiu)人體(ti)EccDNA（染色(se)體(ti)外(wai)環狀DNA）的(de)文章，介(jie)紹了什么是EccDNA與(yu)CircDNA-Seq，以及它的(de)研究(jiu)材料和研究(jiu)內容(rong)概況，這(zhe)里(li)我(wo)們(men)來(lai)詳(xiang)細(xi)展示(shi)一(yi)下這(zhe)篇文章的(de)研究(jiu)流程與(yu)發現。
1、EccDNA提取與測序
根據芽殖(zhi)酵(jiao)母(mu)Circle-Seq EccDNA的方(fang)法優化人體組織中真(zhen)核生物EccDNA的純化。
注：T1-T16：肌(ji)肉(rou)組織樣(yang)本；B1-B16：血液(ye)樣(yang)本；B6A-D，B14A-D：為測(ce)試線(xian)粒體DNA去除(chu)步驟中內切酶之間的差異。T2，T7深度(du)測(ce)序以(yi)檢測(ce)測(ce)序飽(bao)和(he)度(du)。
2、EccDNA測序數(shu)據分(fen)析
3、EccDNA研究(jiu)結果
EccDNA在健康的人體組織和血液中(zhong)很(hen)常見，其大小足以攜帶一個或幾(ji)個完整(zheng)的基因。我們(men)發現EccDNA具有轉(zhuan)錄活性，認為EccDNA通過全長和/或基因片段的表(biao)達(da)促使產生表(biao)型變異(yi)。主(zhu)要結果如下：
3.1 基(ji)于Circle-Seq方法的(de)EccDNA比對
總(zong)共(gong)(gong)檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)來自肌肉(rou)樣本(ben)(ben)的(de)43,460個(ge)hconf EccDNAs，81,066 個(ge)conf EccDNAs和13,655 lowq EccDNAs（每(mei)個(ge)樣本(ben)(ben)106個(ge)細(xi)(xi)胞核）。在白細(xi)(xi)胞中，總(zong)共(gong)(gong)檢(jian)(jian)測(ce)到(dao)6,253個(ge)hconf EccDNAs，3,191個(ge)conf EccDNAs和784個(ge)lowq EccDNAs（每(mei)個(ge)樣本(ben)(ben)104個(ge)細(xi)(xi)胞核）。有130個(ge)EccDNA被定(ding)位到(dao)0.3Mb的(de)TTN基因(yin)。注：Reads覆(fu)蓋(gai)(gai)率＜95%被定(ding)義為低質量(liang)（lowq），reads覆(fu)蓋(gai)(gai)率＞95%的(de)EccDNA，相(xiang)對(dui)于相(xiang)等(deng)長度的(de)相(xiang)鄰區域的(de)總(zong)覆(fu)蓋(gai)(gai)范圍，平均(jun)覆(fu)蓋(gai)(gai)率高于2倍的(de)被定(ding)義為hconf，低于2倍的(de)定(ding)義為conf。
3.2 質粒和重復序列上的EccDNA大小與reads分布
從16個肌肉(rou)樣本中(zhong)鑒定出138,027種不同的EccDNA。所有染色體均以EccDNA序列(lie)表示，其組合長(chang)度為人類基因組的12.6％（389.5 Mb）。使用在EccDNA純化之前添加到肌肉(rou)和(he)血液樣品中(zhong)的內部質(zhi)粒(li)對照(zhao)測量Circle-Seq的靈敏度，Circle-Seq在每個細胞(bao)核的4kb范圍內可檢測到1-250個EccDNA。
3.3 EccDNA斷(duan)裂點的基(ji)因組分(fen)布
大多(duo)數(shu)EccDNA（99％）小于25 kb，而剩(sheng)余的(de)1％來源于斷裂(lie)點(dian)則超過了25 kb。超過一半的(de)EccDNA來自基因或假基因區域（血液55％，組織52％）。
3.4 EccDNA 驗(yan)證與(yu)DNA 缺失(shi)
通過Sanger測(ce)序驗證(zheng)了所(suo)有測(ce)試的(de)(de)EccDNA中的(de)(de)85％（20個(ge)中的(de)(de)17個(ge)），特異EccDNA來自(zi)基因(yin)(yin)間(jian)和基因(yin)(yin)位(wei)點。例如，[ERBB2circle exon 1-7]，其(qi)中包括ERBB2的(de)(de)前七個(ge)內含子和外(wai)顯子。另外(wai)在DAZ4基因(yin)(yin)中，在[DAZ4circle exon 18]形成(cheng)的(de)(de)精確位(wei)點發現DNA缺失。在血液(ye)和肌(ji)肉樣(yang)品(pin)中，還(huan)檢測(ce)到來自(zi)經常(chang)發生(sheng)大量DNA缺失的(de)(de)基因(yin)(yin)位(wei)點的(de)(de)EccDNA，例如HLA（5 Mb，6p21.32-p22.1），KIR（1 Mb，19q13.42）和SERF1A_SMN2（2.5 Mb，5q13.2）。這些發現表(biao)明，大量DNA缺失可(ke)導(dao)致健康人體細胞中的(de)(de)EccDNA產(chan)生(sheng)。
3.5 與染色體、基因密度和轉(zhuan)錄(lu)有(you)關的EccDNA頻率
EccDNAs的基(ji)因(yin)組分布顯示(shi)，富含基(ji)因(yin)的17和19號(hao)染色(se)(se)體每Mb產生(sheng)的EccDNA數目分別比其他染色(se)(se)體高(gao)出了(le)1.7倍(bei)和2.9倍(bei)。另外(wai)，發現EccDNA/Mb與編(bian)(bian)碼基(ji)因(yin)/Mb的比率之間存在正向(xiang)關系(xi)，該結果(guo)表(biao)明編(bian)(bian)碼基(ji)因(yin)的轉錄(lu)或其他特征(zheng)影響了(le)EccDNA形成的頻率。
3.6 來(lai)自(zi)[HIP1circle exon 1]的EccDNA的轉錄本
為(wei)了(le)研究(jiu)EccDNAs是否(fou)被轉錄(lu)，篩選了(le)肌肉組(zu)織中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA序列(lie)，這些序列(lie)可以與檢(jian)(jian)測到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)EccDNA接合點(dian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)事件相(xiang)匹(pi)配。從8名參與者的(de)(de)(de)(de)(de)(de)肌肉樣(yang)本(ben)中鑒定了(le)25種不(bu)同EccDNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)接合點(dian)轉錄(lu)本(ben)。樣(yang)品中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)EccDNA轉錄(lu)本(ben)證實了(le)EccDNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)存在，例如，在五個(ge)參與者中，我們檢(jian)(jian)測到(dao)(dao)TTN基因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分離轉錄(lu)reads，其與檢(jian)(jian)測到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)[TTNcircle]坐標(biao)匹(pi)配，其中一個(ge)大小為(wei)612,228bp。檢(jian)(jian)測到(dao)(dao)T8樣(yang)品中18kb [HIP1circle exon 1]的(de)(de)(de)(de)(de)(de)EccDNA坐標(biao)與來自T8的(de)(de)(de)(de)(de)(de)Huntington interacting protein 1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)第一外(wai)顯(xian)子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA轉錄(lu)之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)完(wan)美重疊。
參考(kao)文獻：
Henrik Devitt M?ller, Marghoob Mohiyuddin, I?igo Prada-Luengo, M. Reza Sailani, Jens Frey Halling et al. Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue[J]. Nature Communications, 2018, 9: 1069.
2018/9/11
轉錄調(diao)控(kong)事(shi)業(ye)
