2018-10-12
前言
單細胞轉錄組測序，指的是以單個(ge)細胞(bao)為(wei)特定研究對象進行(xing)轉錄組測序，并對獲(huo)得(de)的數據(ju)做(zuo)生物信(xin)息學統計分析的方法(fa)。
10x Genomics推出(chu)的(de)ChromiumTM是基于一套分子(zi)條形碼和(he)微(wei)流控(kong)技術的(de)分析系統(tong)，由儀器、試劑盒和(he)信息學(xue)軟(ruan)件組成(cheng)，能全面對接(jie)Illumina測序(xu)儀。該系統(tong)對細(xi)胞(bao)數量選取(qu)靈活，可同時獲(huo)得1000-10000個細(xi)胞(bao)的(de)表(biao)達信息， 根據基因表(biao)達數據實(shi)現細(xi)胞(bao)亞(ya)群分類與細(xi)胞(bao)群體間標記(ji)物篩選，是細(xi)胞(bao)群體檢測、細(xi)胞(bao)異質性以(yi)及細(xi)胞(bao)發育(yu)分化等(deng)研究的(de)方法。
應用方(fang)向
10x Genomics單細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)應(ying)用(yong)(yong)廣泛(fan)，可應(ying)用(yong)(yong)的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類型有：生殖細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、胚(pei)胎細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、神經細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、免疫(yi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、腫瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)等(deng)。
研究方向
1 人類(lei)細(xi)胞圖譜構建
2 腫瘤異質性研究
3 干細胞(bao)發育分(fen)化
4 免疫方(fang)向研究
5 神(shen)經系統發育研究
6 腦發育研究
7 胚胎細胞發育研究
8 疾(ji)病分型(xing)
技(ji)術(shu)原理
u 10x Genomics儀器小巧，但(dan)功能強大，其技術核心是(shi)油滴包(bao)裹的(de)(de)凝膠珠（GEM），該(gai)系統有(you)(you)75萬(wan)種barcoded beads，每個bead上有(you)(you)40-80萬(wan)探針。Barcode（16bp），一(yi)個微珠只對應(ying)于一(yi)種Barcode，通(tong)過Barcode區(qu)分(fen)(fen)凝膠微珠。UMI（10bp），是(shi)一(yi)段隨機序(xu)列，也就是(shi)說每一(yi)個cDNA分(fen)(fen)子(zi)，都有(you)(you)自(zi)己的(de)(de)UMI序(xu)列, UMI的(de)(de)作用是(shi)為(wei)了區(qu)分(fen)(fen)哪些reads是(shi)來自(zi)于一(yi)個原始cDNA分(fen)(fen)子(zi)。
圖1
技術要點
1 通過微流體(ti)“雙(shuang)十字”交叉系統用油(you)滴將(jiang)含Barcoded RT Primers的Gel Beads、細胞和反(fan)應試劑包裹成GEMs（Gel Bead in Emulsion），即(ji)油(you)包水結構(gou)
2 GEMs形成(cheng)后(hou)，細胞裂解(jie)，凝膠珠自動溶(rong)解(jie)釋放大量(liang)barcode序列，隨(sui)后(hou)mRNA逆轉(zhuan)錄產生帶有Barcode和UMI信息的cDNA
3 油滴破碎(sui)，cDNA為模板進行PCR擴增，然(ran)后進行cDNA打斷、加測序(xu)接頭P5及測序(xu)引物R1等傳統二代測序(xu)的建庫過程
4 測序后，得到(dao)每個細胞(bao)的轉錄組(zu)表達譜，Barcode標記細胞(bao)，UMI標記基(ji)因(yin)并記錄表達量
圖(tu)2（圖(tu)片來源(yuan)：10x Genomics Chromium SingleCell3’Solution Application）
操作流程(cheng)
組織或(huo)細胞 → 單細胞懸液制(zhi)備 → 單細胞轉錄組建庫 → 二代測序 → 數據(ju)聚類(lei)分析 → 細胞亞群分類(lei)
樣本準(zhun)備
細胞(bao)類型：新鮮單(dan)細胞(bao)懸浮液
質量要求：細胞活性90%以(yi)上（不含(han)有(you)Ca2+,Mg2+ ），濃度500-2000cell/μl，起始量大(da)于(yu)105個
細胞運輸：細胞保存于凍存液中，利用干冰/液氮運送
信(xin)息分(fen)析
Cell RangerTM分(fen)析(xi)流程(cheng)，是(shi)10x Genomics針對ChromiumTM單細胞(bao)轉錄(lu)組測序(xu)開發的(de)完(wan)整分(fen)析(xi)流程(cheng)，該流程(cheng)能進行細胞(bao)聚(ju)類、差異(yi)基因篩選、差異(yi)基因功能分(fen)析(xi)和細胞(bao)發育分(fen)化軌跡分(fen)析(xi)（圖3、4、5、6）等。
分析(xi)流程(cheng)
測序數據質量統計（比對基因組、基因表達定量）→ 細(xi)胞(bao)過濾與標(biao)準化→ 細胞亞群分(fen)(fen)類 → 差異(yi)基(ji)因篩選 → 差異(yi)基(ji)因功(gong)能(neng)分(fen)(fen)析（GO、KEGG）→ 標記基因篩選
圖3 細胞亞群分類(lei) (Matthew et al, 2018)
圖(tu)4 已有標記基因或差異基因篩(shai)選(Matthew et al, 2018)
圖5 差異基因功能(neng)分析
圖6 細(xi)胞發育分化軌跡(Matthew et al, 2018)
技術優勢
高通(tong)量、短周期(qi)、低成(cheng)本、適(shi)用(yong)范(fan)圍廣
一次可(ke)以測(ce)8個(ge)樣本(ben)，每個(ge)樣本(ben)最多(duo)可(ke)獲得10000個(ge)細胞(bao)轉錄組數據
每個(ge)樣本通道10分鐘內(nei)完成1000-10000個(ge)細胞制備
一個(ge)油珠(zhu)包含2個(ge)細胞的(de)幾率低（Low Doublet Rate）：0.8%/1000個(ge)細胞
單個細(xi)胞捕獲(huo)率(lv)高(gao)達65%，細(xi)胞基(ji)因表達獲(huo)取高(gao)效精(jing)準
周期短，快的(de)一天內完成文庫構(gou)建(jian)
與(yu)傳統(tong)人工細(xi)胞分離方法(fa)相比，價(jia)格更優
對細胞(bao)類型(xing)(xing)和(he)大小幾乎(hu)無限(xian)制，已成功應用于腫瘤細胞(bao)異質性(xing)研究、免疫細胞(bao)分型(xing)(xing)和(he)疾病分型(xing)(xing)等領域
文獻總(zong)結
年(nian)份 | 期刊 | 影響因子 | 研究方向 |
2018.8 | Science | 31.853 | 人腎(shen)腫瘤細胞(bao)鑒(jian)定和組成識別 |
2018.2 | Cancer Research | 9.122 | 腫瘤內皮細胞 |
2017.12 | Nature Communications | 12.124 | 乳腺上皮細胞 |
2017.5 | Nature | 40.137 | 小腸干細胞 |
2017.4 | Nature Method | 25.062 | 外周血單(dan)核細胞 |
2016.12 | Cell | 30.409 | CRISPR與10x Genomics單細胞轉錄組結合 |
