2017-09-27
研(yan)究(jiu)背景
m6A（N6-methyladenosine，6-甲(jia)基腺嘌呤(ling)）是(shi)真核生物mRNA內部序列中最常(chang)見(jian)的(de)(de)(de)一種甲基(ji)化(hua)修(xiu)飾，同時可以(yi)功(gong)能性的(de)(de)(de)調節真核(he)生物(wu)的(de)(de)(de)轉(zhuan)錄組(zu)從而影響(xiang)mRNA的剪接、出核(he)、定位、翻譯和穩定。m6A RNA出(chu)現在多種重(zhong)要的細(xi)胞生命過(guo)程(cheng)中，意味著mRNA甲(jia)基(ji)化參(can)與了多(duo)種生物(wu)學過程，如干細胞(bao)分化、生物(wu)節律等。最(zui)近新發現(xian)的m6A 識(shi)別蛋白YTHDF2可(ke)以對(dui) m6A 去(qu)甲基化。
哺(bu)乳(ru)動物早期(qi)胚胎發育過程中，胚胎中許多(duo)蛋白的產生依(yi)賴于來自母源的mRNA調控的(de)基因表達(da)，但是在經歷母體-合子過渡（maternal-to-zygotic transition）期(qi)間(jian)后，胚胎將激(ji)活自身的基因組(zu)從而產生變(bian)化，此后大量來(lai)自母(mu)源的mRNA將(jiang)被迅(xun)速清除(chu)。斑馬魚ythdf2在早(zao)期胚胎中普遍(bian)表達。本(ben)研(yan)究通過在斑馬魚發育早(zao)期階(jie)段(duan)使ythdf2喪失功能(neng)來檢測m6A 依賴性RNA是否(fou)減少。
研究結果(guo)
實驗表明，純合的第(di)一代ythdf2-/-斑馬魚突(tu)變體沒有產(chan)生表型，但將純合的(de)第一代(dai)ythdf2-/-斑馬魚(yu)進行雜(za)交時(shi)發現大(da)約有超過70%的(de)后代無法(fa)發育通過第一個細(xi)胞(bao)期，然后進一步(bu)發現這種致(zhi)死(si)可能是由(you)于純合ythdf2-/-雄性斑馬魚的精子缺陷導致。
圖1.斑馬魚(yu)早期胚(pei)胎樣本構建
利用(yong)m6A-seq發現，40% 的基因(yin)轉錄本(ben)存在m6A位(wei)點，超過36%的母(mu)體基因具有(you)m6A甲基(ji)化位點。受精(jing)后4h之前(qian)，甲基化基因比非甲基化基因豐度更高且主要富(fu)集在磷代謝和細胞周期(qi)調控功(gong)能(neng)上(shang)。
圖2.未甲基化基因與(yu)甲基化基因比對
圖3.甲基化基因GO富集分析
進(jin)一步研(yan)究發現，與(yu)野生型相(xiang)比，受(shou)精(jing)后(hou)4h時，ythdf2?/?胚胎(tai)中mRNA的m6A甲基化修飾提高了50%以上，證明Ythdf2會(hui)影響母體mRNA的甲(jia)基化。而且它們的清除會因為YTHDF2的缺失而受(shou)阻。對受(shou)精后4h時間點下母體ythdf2?/?樣本進(jin)行測序分(fen)析(xi)，共發(fa)現3292個基因(yin)高表達(da)并存在(zai)甲基化，其中超過60%為母體基因。經過(guo)篩(shai)選，其(qi)中135個基因為(wei)共有(you)基因，這(zhe)些共有(you)基因主(zhu)要富集在磷代謝(xie)、細胞周期過程(cheng)和繁殖過程(cheng)中。
圖4.受(shou)精(jing)后4h時間點利用不同測序(xu)技(ji)術發現的m6A甲基(ji)化修飾轉錄本(ben)
圖5.共有基(ji)因GO富集分析
圖6.RNA甲基(ji)化motif
研究結論：
本研究表(biao)明，m6A甲基(ji)化修飾在早期胚胎(tai)發育中具(ju)有(you)非(fei)常關鍵(jian)的作用。超過三(san)分之(zhi)一的斑馬魚母(mu)本mRNA可以通過N6甲基腺苷(gan)（m6A）進行修飾調控，而(er)且(qie)這些母本mRNA清除過(guo)(guo)程也是(shi)通過(guo)(guo)m6A結合蛋白Ythdf2完成的。在斑馬(ma)魚胚胎中去除Ythdf2，會減緩了(le)m6A修飾母(mu)本mRNA的衰變，并(bing)且阻止合子基(ji)因組激活。胚胎無法及時啟動MZT，就會引發(fa)細(xi)胞周(zhou)期停頓(dun)，導致(zhi)發(fa)育延遲。
目(mu)前對m6A的轉錄組研究方(fang)法為(wei)MeRIP-seq（mRNA甲(jia)基化測序）的(de)方(fang)法，其原理是通過m6A特異(yi)性抗(kang)體對(dui)細胞內具有m6A修(xiu)飾的(de)RNA片(pian)段進行免疫共(gong)沉淀，將(jiang)富集下來的RNA片段進行高通量測序。結合生物信息學分(fen)析，即(ji)可(ke)在(zai)轉錄(lu)組(zu)范圍(wei)內(nei)對m6A修飾(shi)進行系統研究。
參考(kao)文獻：Zhao B S, Wang X, Beadell A V, et al. m(6)A-dependent maternal mRNA clearance facilitates zebrafish maternal-to-zygotic transition.[J]. Nature, 2017, 542(7642):475.
