2019-02-14
轉錄(lu)組結果(guo)出來后(hou)往往會做QPCR驗證，但結果(guo)驗證不(bu)(bu)上就讓人苦惱了，下面咱們就好好分(fen)析一下驗證不(bu)(bu)上的原因。
1. 基(ji)因選的是否合適？
首先，驗(yan)證(zheng)挑(tiao)選的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)個(ge)數(shu)不能太少。其(qi)次，QPCR驗(yan)證(zheng)一(yi)般選擇轉錄組(zu)結果中的(de)(de)(de)差(cha)異(yi)基(ji)因(yin)(yin)，差(cha)異(yi)倍(bei)數(shu)根據生(sheng)物(wu)學重(zhong)(zhong)復數(shu)量可進行調節，比如三個(ge)重(zhong)(zhong)復的(de)(de)(de)需要(yao)差(cha)異(yi)在2倍(bei)以上(shang)，5-10個(ge)重(zhong)(zhong)復的(de)(de)(de)差(cha)異(yi)倍(bei)數(shu)可以適當降低，重(zhong)(zhong)復數(shu)大(da)于(yu)10的(de)(de)(de)也可以只考慮P值。另(ling)外，應避免選擇表達量過低的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)。一(yi)般在有生(sheng)物(wu)學重(zhong)(zhong)復的(de)(de)(de)情況下，要(yao)求組(zu)內三個(ge)生(sheng)物(wu)學重(zhong)(zhong)復的(de)(de)(de)read count >=10；FPKM值至少在一(yi)個(ge)組(zu)大(da)于(yu)1。
2. 樣本選的有沒有代表(biao)性？
當(dang)一(yi)(yi)個組的(de)(de)生物學重(zhong)復(fu)比較多的(de)(de)時候，往往只會選(xuan)取部分樣本(ben)(ben)做QPCR，但要(yao)注意同(tong)一(yi)(yi)基(ji)因(yin)(yin)在(zai)不同(tong)樣本(ben)(ben)個體(ti)間的(de)(de)表達也(ye)是有差異的(de)(de)，所以選(xuan)擇(ze)的(de)(de)樣本(ben)(ben)就要(yao)求能代表組內的(de)(de)整體(ti)情況，排除基(ji)因(yin)(yin)在(zai)樣本(ben)(ben)間的(de)(de)特異性。
3. 引(yin)物設(she)計的(de)是否(fou)合理？
在RNA-Seq中大多數基(ji)因會(hui)(hui)包含不(bu)止(zhi)一個轉(zhuan)錄本，甚至有(you)一些特別復雜的(de)(de)轉(zhuan)錄本形式，如(ru)果設(she)計(ji)引(yin)物(wu)不(bu)合(he)理就會(hui)(hui)使QPCR結果不(bu)準，還可能(neng)會(hui)(hui)有(you)假(jia)基(ji)因的(de)(de)干擾。所以，QPCR的(de)(de)引(yin)物(wu)盡可能(neng)全都設(she)計(ji)在基(ji)因的(de)(de)轉(zhuan)錄本共有(you)外顯子上，別是某些特定(ding)轉(zhuan)錄本的(de)(de)；引(yin)物(wu)設(she)計(ji)好以后可以到NCBI做Primer Blast，保證引(yin)物(wu)不(bu)會(hui)(hui)Blast到一些基(ji)因組上的(de)(de)假(jia)基(ji)因上，避(bi)免假(jia)基(ji)因表達的(de)(de)干擾。
4. ; 轉(zhuan)錄組和QPCR的RNA是同(tong)一批(pi)次嗎？
RNA表(biao)(biao)(biao)達具有時(shi)間(jian)和空間(jian)的(de)(de)(de)特(te)異性，所(suo)以不(bu)(bu)同時(shi)刻(ke)或者(zhe)是同一(yi)時(shi)刻(ke)不(bu)(bu)同組織內RNA表(biao)(biao)(biao)達的(de)(de)(de)數(shu)目(mu)都(dou)有著(zhu)較(jiao)大的(de)(de)(de)差別(bie)，不(bu)(bu)同批(pi)次樣品的(de)(de)(de)RNA表(biao)(biao)(biao)達也會有所(suo)不(bu)(bu)同，而且即使是同一(yi)批(pi)樣本，保存時(shi)間(jian)與保存方式不(bu)(bu)同也會對(dui)RNA造成影響。因此做(zuo)QPCR驗證的(de)(de)(de)RNA需要與做(zuo)轉錄組的(de)(de)(de)RNA來源保持一(yi)致，間(jian)隔的(de)(de)(de)時(shi)間(jian)也盡量(liang)不(bu)(bu)要太久。
5. 樣品的(de)關(guan)系(xi)是(shi)否(fou)弄反？
一(yi)般(ban)QPCR驗(yan)證(zheng)不(bu)上可能是部分(fen)基因驗(yan)證(zheng)效果不(bu)好(hao)，但如果QPCR結(jie)果與轉錄(lu)組的(de)結(jie)果很明顯不(bu)一(yi)致，絕(jue)大部分(fen)基因上下調關系相反(fan)，就要考慮樣(yang)品(pin)弄反(fan)的(de)可能性。可能是轉錄(lu)組實驗(yan)分(fen)析中導致樣(yang)品(pin)弄反(fan)，也(ye)有可能是做QPCR過程中弄反(fan)了樣(yang)品(pin)，需要進一(yi)步核實確(que)定了。
除了以(yi)上提到的(de)因(yin)素，QPCR實(shi)驗操(cao)作要(yao)(yao)求(qiu)也比(bi)較(jiao)嚴(yan)格，否則是(shi)失之毫(hao)厘差之千(qian)里，所以(yi)千(qian)萬(wan)要(yao)(yao)注意。大家還需要(yao)(yao)知(zhi)道，轉(zhuan)錄組測序與QPCR定量雖(sui)然都(dou)看基(ji)因(yin)表達(da)，但是(shi)他們確實(shi)兩種不一(yi)樣的(de)方法，會有(you)很大概率的(de)不一(yi)致，要(yao)(yao)做好心(xin)理預(yu)期。
新年伊始，這篇小(xiao)軟(ruan)(ruan)文就教(jiao)教(jiao)大家在轉錄組測序的QPCR驗證(zheng)中如(ru)何避避坑，告(gao)別(bie)驗證(zheng)煩惱。
