2019-08-20
超實用干貨！如何設計qPCR引物來驗證lncRNA測序結果！
在(zai)近(jin)十余(yu)年的(de)(de)生命(ming)科學研(yan)究中非(fei)編(bian)(bian)碼RNA可(ke)(ke)謂(wei)是火(huo)(huo)的(de)(de)研(yan)究領域之一(yi)，從2006年獲得諾(nuo)貝爾醫學獎的(de)(de)siRNA干擾(rao)技術，到近(jin)幾年異常火(huo)(huo)爆的(de)(de)microRNA，再(zai)到轉錄調控研(yan)究藍海(hai)的(de)(de)lncRNA，可(ke)(ke)謂(wei)如火(huo)(huo)如荼。長(chang)非(fei)編(bian)(bian)碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一(yi)類長(chang)度大(da)于200個核苷酸的(de)(de)非(fei)編(bian)(bian)碼RNA。
與其他(ta)非編碼(ma)RNA不同(tong)，lncRNA可以折疊(die)成復雜的(de)二(er)級(ji)結(jie)構或更高級(ji)結(jie)構，有更大的(de)潛能識別蛋白(bai)質和靶標。近些年的(de)文獻研究表明，lncRNA參與X染色(se)體沉默，基(ji)因組印記以及染色(se)質修飾，轉錄激活，轉錄干(gan)擾，核內運輸等(deng)多種重要的(de)調控過程。
目前lncRNA根據其在基因組上相對于蛋白編碼(ma)基因的位置可(ke)以分為五類：antisense lncRNA, overlapping lncRNA, large intergenic noncoding RNA (linc RNA), intronic lncRNA和exonic lncRNA。
圖(tu)源網絡侵刪
在細胞核(he)內的(de)(de)(de)(de)lncRNAs，它(ta)(ta)們(men)(men)的(de)(de)(de)(de)作(zuo)(zuo)用主要是(shi)通過(guo)引導染色質修飾蛋白（eg.多梳抑制(zhi)復(fu)合物PRC2, 組(zu)蛋白甲基(ji)(ji)轉移酶H3K9）到特(te)定(ding)(ding)的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)組(zu)位(wei)(wei)點(dian)(dian)。根據目(mu)標(biao)位(wei)(wei)點(dian)(dian)的(de)(de)(de)(de)不同(tong)分為cis-acting lncRNAs和trans-acting lncRNAs。cis-acting lncRNAs控制(zhi)在它(ta)(ta)們(men)(men)轉錄(lu)位(wei)(wei)點(dian)(dian)附近或(huo)者(zhe)同(tong)一(yi)染色體(ti)上長距離的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)。然而trans-acting lncRNAs可(ke)以抑制(zhi)或(huo)激活獨立位(wei)(wei)點(dian)(dian)的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)表(biao)達(da)。盡管目(mu)前科研人員提出不同(tong)的(de)(de)(de)(de)識別機制(zhi)，但是(shi)這(zhe)兩種lncRNAs的(de)(de)(de)(de)作(zuo)(zuo)用定(ding)(ding)位(wei)(wei)機制(zhi)仍然沒有被完全(quan)解釋，尤其是(shi)關于(yu)cis-acting lncRNAs如(ru)何保持它(ta)(ta)們(men)(men)的(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)位(wei)(wei)點(dian)(dian)和trans-acting lncRNAs如(ru)何找到遠距離的(de)(de)(de)(de)目(mu)標(biao)位(wei)(wei)點(dian)(dian)。
同時，許多lncRNAs介導的(de)基因調控機制(zhi)在細胞質中被發現。在細胞質內的(de)lncRNAs，它們的(de)序(xu)列與(yu)來自同一(yi)染色(se)體位(wei)點(dian)或獨立位(wei)點(dian)的(de)轉錄本互補(bu)。它們通過互補(bu)配(pei)對來識別目(mu)標(biao)(biao)位(wei)點(dian)，從(cong)而也能(neng)調控蛋白質的(de)翻(fan)譯過程。同樣(yang)，lncRNAs能(neng)增強(qiang)和降(jiang)低(di)目(mu)標(biao)(biao)mRNA的(de)穩定性。另一(yi)種特殊的(de)lncRNA作(zuo)用方(fang)式(shi)是(shi)作(zuo)為競(jing)爭(zheng)性內源RNA（ceRNAs），通過結合或隔離(li)miRNAs來防止(zhi)目(mu)標(biao)(biao)mRNA的(de)抑制(zhi)。這代表了一(yi)種新的(de)RNA調控回路(lu)，不(bu)同類型的(de)RNA（編(bian)碼和非編(bian)碼）都可以相互交流通過競(jing)爭(zheng)共(gong)享的(de)miRNAs。
LncRNA的(de)應用
目前，越(yue)(yue)來(lai)(lai)越(yue)(yue)多(duo)關(guan)于(yu)lncRNA研究的文獻(xian)出(chu)現(xian)在Nature、Science、Cell等頂級(ji)學術期(qi)刊上，研究內容也涉(she)及多(duo)個(ge)領域，如腫瘤發生(sheng)，細胞分(fen)化，全(quan)能性(xing)等。越(yue)(yue)來(lai)(lai)越(yue)(yue)多(duo)的研究者開始關(guan)注lncRNA在生(sheng)命(ming)活動中的重要作用，借助lncRNA高通量測(ce)序技術，未(wei)來(lai)(lai)在各領域會有更多(duo)的lncRNA調(diao)控機制(zhi)被深入全(quan)面地解析(xi)。
LncRNA測序技術??
LncRNA測序是研究有參考基因組(zu)物種(zhong)的(de)特(te)定(ding)(ding)組(zu)織(zhi)或細胞在某個(ge)(ge)特(te)定(ding)(ding)時期轉錄出的(de)所有lncRNA和mRNA，所以(yi)lncRNA測序既包(bao)含(han)對(dui)lncRNA的(de)分析也包(bao)含(han)了(le)對(dui)mRNA的(de)分析。LncRNA測序要滿足的(de)兩個(ge)(ge)必(bi)要條件：1）必(bi)須有參考基因組(zu)，常(chang)見的(de)包(bao)括人(ren)、小鼠、豬、擬南芥、玉(yu)米等；2）有相應的(de)核糖(tang)體去除試(shi)劑盒。因為(wei)(wei)lncRNA建(jian)庫采(cai)用去核糖(tang)體建(jian)庫方式，文庫中會包(bao)含(han)lncRNA，mRNA和其他RNA，所以(yi)推薦12G的(de)clean data/樣品(pin)，如果希(xi)望通(tong)過lncRNA測序數(shu)據分析circRNA，則需(xu)要更多的(de)數(shu)據量15-20G。派森諾有專業的(de)實驗人(ren)員，嚴格的(de)質量檢控，確保我們(men)的(de)數(shu)據真(zhen)實可靠(kao)，為(wei)(wei)您提供優質的(de)測序服務。
分析結果展示圖(tu)
圖1：IGV顯(xian)示的基因結構及(ji)表(biao)達圖
圖2：表達量分布圖
圖3：lncRNA和miRNA的聯合分(fen)析
lncRNA測序后的qPCR驗證
在做完測序之后，大(da)家都會(hui)用RT-qPCR來驗證測序結果的(de)(de)可靠性。但是很多人會(hui)對(dui)這些問題有困(kun)擾，選哪個(ge)lncRNA？變化(hua)倍(bei)數(shu)大(da)的(de)(de)？表達量高(gao)的(de)(de)？選lncRNA的(de)(de)哪段設計引(yin)物(wu)？其(qi)它(ta)基(ji)因有重疊怎么辦？下(xia)面我們就來為大(da)家梳理(li)一下(xia)做qPCR定量實驗來驗證lncRNA測序的(de)(de)幾個(ge)關(guan)鍵點：
1. 用和測序同(tong)一(yi)批次(ci)的(de)RNA樣品做(zuo)RT-qPCR，最好是同(tong)一(yi)管RNA（如果(guo)是由公司提取RNA，可以返樣）；如果(guo)要重(zhong)提，則要用和測序樣品同(tong)一(yi)批次(ci)的(de)細胞或同(tong)一(yi)塊組織。
2. 最好選(xuan)擇(ze)基(ji)因間的lncRNA， 其次(ci)選(xuan)擇(ze)位于(yu)其他基(ji)因intron區域的lncRNA，不能選(xuan)與其他基(ji)因exon重疊的lncRNA，否(fou)則，RT-qPCR結果就混合了兩個基(ji)因的表達(da)量，從(cong)而(er)導(dao)致實(shi)驗(yan)誤(wu)差較大。
3. 表(biao)(biao)達(da)量高(gao)的lncRNA優于表(biao)(biao)達(da)量低(di)的lncRNA，更(geng)容易做(zuo)RT-qPCR，Ct值更(geng)低(di)，結果更(geng)可(ke)靠。
4. RNA-seq計(ji)算lncRNA表(biao)(biao)達(da)(da)量(liang)和篩選差(cha)異基因時，用(yong)的是(shi)lncRNA全長reads count的總和，不代表(biao)(biao)每個(ge)區段都有表(biao)(biao)達(da)(da)或表(biao)(biao)達(da)(da)差(cha)異。因此，我們選擇(ze)在組間有顯著表(biao)(biao)達(da)(da)差(cha)異的lncRNA，利用(yong)IGV程(cheng)序可以看到哪(na)個(ge)區段表(biao)(biao)達(da)(da)量(liang)峰高，從而針(zhen)對這(zhe)個(ge)區段進(jin)行引物設計(ji)做(zuo)qPCR，能(neng)保證萬無一失。
最后，由于測序(xu)和RT-qPCR是(shi)兩(liang)種技術平臺它們的原理也不(bu)同，所以RNA-Seq和RT-qPCR計算出來(lai)的變(bian)化倍數不(bu)可比(bi)，只要變(bian)化趨勢相同就算結果(guo)一致(zhi)。
