2019-08-27
CircRNA（環狀RNA）是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，通過特殊的選擇性剪切產生封閉環狀結構的非編碼RNA，可與miRNA結合，起到miRNA海綿作用（miRNA sponge），在疾病中發揮著重要的調控作用，是繼miRNA后RNA領域新的研究熱點。利用高通量測序技術，對生物樣本中的CircRNA進行鑒定、表達豐度檢測及結構分析，可以推動更深入的基因表達調控研究。隨之而來的對于高通量結果的后期驗證手段，也是科研工作者們極為關心的內容，以下將對不同的驗證手段展開說明。
目前常用的幾種CircRNA的鑒定及(ji)功能驗證(zheng)方法主要包(bao)括(kuo)：qRT-PCR定量驗證(zheng)、Northern blot驗證(zheng)、過表(biao)達（正向驗證(zheng)）、基(ji)因沉(chen)默（反向驗證(zheng)）。
qRT-PCR定量驗證
qRT-PCR法進(jin)行CircRNA定量驗(yan)證是比較常用的驗(yan)證方法，該(gai)技術的關鍵在于反向引(yin)物(wu)的設計，其核心是構建包含反向剪切位點的引(yin)物(wu)設計序列。CircRNA全(quan)長調取及(ji)引(yin)物(wu)設計方法詳述如下(xia)：
1.在研究CircRNA時(shi)，主要(yao)利用Circbase數(shu)據庫 (
//www.Circbase.org/)獲得CircRNA的序列；
2.將網(wang)頁中的 Circ sequence 選項更改為“spliced”，再點(dian)擊 “search”，即可下載CircRNA的全(quan)長序(xu)列信息；
3.點擊fasta下載序列；
4.針對上(shang)(shang)述(shu)序列(lie)，即可(ke)設(she)(she)(she)計CircRNA的(de)全長序列(lie)設(she)(she)(she)計引(yin)物(wu)，設(she)(she)(she)計方(fang)法與(yu)(yu)常(chang)規(gui)基因(yin)引(yin)物(wu)設(she)(she)(she)計類似，但重點是(shi)(shi)設(she)(she)(she)計引(yin)物(wu)時的(de)位置，常(chang)規(gui)手段(duan)是(shi)(shi)圍繞目(mu)的(de)片段(duan)的(de)上(shang)(shang)下(xia)游分別設(she)(she)(she)計PCR引(yin)物(wu)，稱之(zhi)為convergent primer，需擴增的(de)片段(duan)位于上(shang)(shang)下(xia)游引(yin)物(wu)之(zhi)間(jian)。而對于circRNA，尤其外顯子環化circRNA，除跨環狀RNA引(yin)物(wu)剪切點（backsplice junction）處(chu)不同于linear RNA之(zhi)外，body區與(yu)(yu)linearRNA是(shi)(shi)一致(zhi)的(de)。因(yin)此，驗證(zheng)時需要(yao)特異性針對backsplice junction位點處(chu)設(she)(she)(she)計primer，稱之(zhi)為divergent primer（見(jian)圖1）。
圖1：convergent primer vs divergent primer
此外，為了增(zeng)強circRNA的(de)驗證效率，一般要求(qiu)起始模板盡量(liang)需滿足(zu)以下要求(qiu)（3 free）：
1. DNA free；
2. rRNA free；
3. linearRNA free。?
所(suo)以可以在(zai)驗(yan)證前期進行DNase處理total RNA，然后用RNase R去除線性(xing)RNA，最后再進行驗(yan)證。
Northern blot驗證
探(tan)針(zhen)的(de)設(she)計是驗(yan)(yan)證(zheng)成功的(de)關鍵因素(su)， 對(dui)于(yu)內含子環化(hua)(hua)CircRNA，可以根據內含子序列設(she)計探(tan)針(zhen)（圖(tu)(tu)2 a）；對(dui)于(yu)外顯子環化(hua)(hua)產生(sheng)的(de)CircRNA，盡可能(neng)跨越backsplice junction位點(dian)設(she)計探(tan)針(zhen)（圖(tu)(tu)2 b）。驗(yan)(yan)證(zheng)策略：對(dui)free RNA、total RNA以及genome DNA同時進行雜交驗(yan)(yan)證(zheng)。
圖2. CircRNA定量驗證引(yin)物設計示意圖
過表達（正向驗證）
CircRNA的(de)成環機制(zhi)有很多，其中基于(yu)CircRNA側翼的(de)反向(xiang)互補(bu)序列(lie)(lie)（Alu序列(lie)(lie)）是(shi)目前(qian)公(gong)認的(de)一種成環機制(zhi)。因此我們可以通過PCR擴增(zeng)目標區域（包(bao)含CircRNA側翼的(de)Alu元(yuan)件或者內部的(de)堿基互補(bu)序列(lie)(lie)）、根據限制(zhi)性(xing)酶切位(wei)點進(jin)行(xing)酶切并連接到(dao)載體上；過表達(da)載體轉染；定(ding)量PCR檢測轉染效率；divergent primers鑒定(ding)CircRNA過表達(da)倍數(shu)等技術(shu)手段驗證CircRNA。過表達(da)策略(lve)：
⑴ 擴增(zeng)目標區域包含CircRNA側翼Alu序列或內部堿基互補序列，側翼上下游1kb處過表(biao)達效率(lv)更佳(jia)；⑵目標區域擴增(zeng)基于基因組DNA為模板。
基因沉默（反向驗證）
和過(guo)表達(da)策略相(xiang)反，我們可以通過(guo)siRNA干(gan)擾(rao)(rao)封閉CircRNA的功能。CircRNA敲除(chu)思路主要針(zhen)對CircRNA backsplice junction處序列(lie)信息設(she)計siRNA，對于內(nei)含(han)子(zi)環化(hua)CircRNA，也可針(zhen)對內(nei)含(han)子(zi)區域設(she)計相(xiang)應(ying)siRNA進(jin)行干(gan)擾(rao)(rao)（圖(tu)3）。
圖3.基于(yu)siRNA敲除策略
