2017-09-20
可變剪切事件的(de)發生增(zeng)加(jia)了(le)后生動(dong)物的(de)轉錄(lu)組(zu)和蛋白組(zu)的(de)多樣性。但是(shi)，對于可(ke)變剪(jian)(jian)切(qie)在單細(xi)胞中的(de)(de)(de)(de)活躍程(cheng)度和功能，目前(qian)還(huan)知之甚(shen)少。美國遺(yi)(yi)傳醫學研究所的(de)(de)(de)(de)主(zhu)(zhu)任Jef D. Boeke教(jiao)授帶領(ling)團隊利(li)用單分(fen)子(zi)全長測序技術(shu)，通過一(yi)(yi)個(ge)(ge)開放(fang)性(xing)軟件(jian)SpliceHunter來發(fa)掘裂(lie)殖酵(jiao)母減數分(fen)裂(lie)時期(qi)的(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)組特征，發(fa)表(biao)在《Genome Research》，影響(xiang)因(yin)子(zi)11.922。測序發(fa)現在裂(lie)殖酵(jiao)母的(de)(de)(de)(de)減數分(fen)裂(lie)時期(qi)，發(fa)現17,669個(ge)(ge)異構(gou)(gou)體(ti)，其中發(fa)生了14,353個(ge)(ge)可(ke)變剪(jian)(jian)切(qie)事件(jian)。另外檢測到了770個(ge)(ge)新(xin)轉錄(lu)本和53個(ge)(ge)預測蛋(dan)白(bai)，表(biao)明與其他(ta)物(wu)(wu)種的(de)(de)(de)(de)同(tong)(tong)源性(xing)和理論(lun)的(de)(de)(de)(de)穩(wen)定結構(gou)(gou)遺(yi)(yi)傳。并且(qie)報告了異構(gou)(gou)體(ti)中可(ke)變剪(jian)(jian)切(qie)的(de)(de)(de)(de)復雜(za)性(xing)，包含(han)683個(ge)(ge)分(fen)子(zi)間區共同(tong)(tong)聯系的(de)(de)(de)(de)內含(han)子(zi)對。對這些因(yin)素的(de)(de)(de)(de)評(ping)估表(biao)明主(zhu)(zhu)要的(de)(de)(de)(de)新(xin)異構(gou)(gou)體(ti)并不都是(shi)特殊條(tiao)件(jian)下形成的(de)(de)(de)(de)可(ke)譯轉錄(lu)本，但是(shi)這些評(ping)估結果和生物(wu)(wu)學功能性(xing)新(xin)轉錄(lu)本是(shi)一(yi)(yi)致的(de)(de)(de)(de)。研究結果突出了裂(lie)殖酵(jiao)母的(de)(de)(de)(de)性(xing)發(fa)育(yu)過程(cheng)中異構(gou)(gou)體(ti)水平的(de)(de)(de)(de)多樣性(xing)和動態變化。
實驗發現4h之后，裂殖酵母的減(jian)數(shu)分裂開始，在6h的時候完成減(jian)數(shu)分裂。實驗選取(qu)0-10h的時間段，每兩個小時取(qu)樣(yang)一(yi)次，每個時間點兩次重(zhong)復。對AS事(shi)件(jian)類型定(ding)義(yi)為8種：外顯子(zi)(zi)跳躍，包含外顯子(zi)(zi)，內含子(zi)(zi)保留，外顯子(zi)(zi)包含內含子(zi)(zi)，可(ke)變(bian)受體(ti)，可(ke)變(bian)供體(ti)，可(ke)變(bian)受體(ti)/供體(ti)，新外顯子(zi)(zi)。示例圖(tu)見圖(tu)1。
圖1 PacBio測序的轉(zhuan)錄組(zu)分(fen)析(xi)總結
三代測序共獲得(de)2,266,791個CCSreads，其中(zhong)包含(han)(han)1,322,840個FL CCSreads。過(guo)濾后鑒定出(chu)424,511個Iso-seq reads (Read of insert)（圖(tu)(tu)2A）。CCSreads的(de)(de)平(ping)(ping)均(jun)(jun)(jun)長度是1285bp，比之前(qian)的(de)(de)文章結果要略(lve)長。FL CCS reads和Iso-seq reads的(de)(de)平(ping)(ping)均(jun)(jun)(jun)長度是1,094bp和1,178bp，長度分(fen)布不隨時(shi)間(jian)點發生變化(hua)（圖(tu)(tu)2B）。PacBio測序發現(xian)了(le)(le)(le)裂(lie)殖酵母的(de)(de)6,199個基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)（所有(you)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)90%左右）。每個基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)FL CCS reads的(de)(de)平(ping)(ping)均(jun)(jun)(jun)覆蓋(gai)次數(shu)是71（圖(tu)(tu)2C），許多基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)覆蓋(gai)次數(shu)超過(guo)100，有(you)利(li)于(yu)對新(xin)轉錄本(ben)(ben)進行深入研究(jiu)。利(li)用PomBase定義（非）編(bian)(bian)碼(ma)RNA和假基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，發現(xian)了(le)(le)(le)4,993（97.1%）個編(bian)(bian)碼(ma)蛋白基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，1，121（73%）個非編(bian)(bian)碼(ma)RNA基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)和18（62.1%）個假基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)。對于(yu)FL CCSreads來說，97.4%比對到了(le)(le)(le)編(bian)(bian)碼(ma)蛋白基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，這代表了(le)(le)(le)所有(you)獲得(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)80%，表明編(bian)(bian)碼(ma)蛋白基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)高(gao)覆蓋(gai)率（圖(tu)(tu)2D）。有(you)趣的(de)(de)是，發現(xian)編(bian)(bian)碼(ma)蛋白的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)和ncRNA趨勢(shi)相(xiang)反，RNA分(fen)子比例在減數(shu)分(fen)裂(lie)中(zhong)期(qi)先減少(shao)，在后期(qi)又(you)增加（圖(tu)(tu)E）。盡管大部分(fen)的(de)(de)reads含(han)(han)有(you)0或者(zhe)1個內含(han)(han)子，但是還有(you)190，101個reads有(you)多重(zhong)內含(han)(han)子（圖(tu)(tu)2F）。另外統計了(le)(le)(le)reads的(de)(de)5’或者(zhe)3’端與對應(ying)的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)轉錄本(ben)(ben)起(qi)始(shi)位(wei)置（TSS）或者(zhe)轉錄本(ben)(ben)終止位(wei)置的(de)(de)距離(li)（TES）。從平(ping)(ping)均(jun)(jun)(jun)水平(ping)(ping)看，Reads在注(zhu)釋基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)(de)5‘端的(de)(de)上(shang)游延伸了(le)(le)(le)232bp（圖(tu)(tu)2G），3’端的(de)(de)下游延伸了(le)(le)(le)188bp（圖(tu)(tu)2H），暗示可變的(de)(de)5’和3’UTRs。
圖2 PacBio reads的一(yi)般特性
研究發現SPAC12B10.05（icp55）有(you)59個明顯的(de)聚腺苷(gan)酸mRNA異(yi)構(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)，包(bao)含(han)(han)(han)了(le)不同的(de)AS剪切(qie)(qie)事件類(lei)型(xing)(xing)（圖(tu)3A）。在S.pombe中發現的(de)AS類(lei)型(xing)(xing)的(de)實例如(ru)下：可(ke)變剪切(qie)(qie)受體(ti)(ti)類(lei)型(xing)(xing)，SPCC1281.08（wtf11）；包(bao)含(han)(han)(han)外顯子類(lei)型(xing)(xing)，SPBC1703.10（ypt1）；多(duo)重外顯子跳躍(yue)類(lei)型(xing)(xing)，SPCC1235.11（mpc1）；外顯子包(bao)含(han)(han)(han)內含(han)(han)(han)子類(lei)型(xing)(xing)，SPAC144.02(iec1)；內含(han)(han)(han)子保留類(lei)型(xing)(xing)，SPAPB8E5.05（mfm1）和(he)新(xin)外顯子類(lei)型(xing)(xing)，SPAC1296.03c（sxa2）（圖(tu)3B）。還(huan)發現，一些新(xin)轉(zhuan)錄本對(dui)應的(de)reads數不比注(zhu)釋轉(zhuan)錄本少，甚至更多(duo)（圖(tu)3C）。很多(duo)新(xin)異(yi)構(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)的(de)剪切(qie)(qie)模式和(he)相(xiang)(xiang)應的(de)注(zhu)釋異(yi)構(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)有(you)密(mi)切(qie)(qie)關系(xi)，一些新(xin)的(de)異(yi)構(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)和(he)相(xiang)(xiang)應的(de)注(zhu)釋異(yi)構(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)相(xiang)(xiang)比，展(zhan)現出明顯的(de)時間進程模式。表明新(xin)異(yi)構(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)可(ke)能被暫(zan)時性(xing)差異(yi)調(diao)控。
圖3 S.pombe減數分裂時期(qi)可變剪切(qie)事件的實例分析(xi)
在(zai)S.pombe中(zhong)主要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)(ke)變剪(jian)切(qie)類(lei)(lei)型是(shi)(shi)(shi)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)保留，這可(ke)(ke)(ke)能是(shi)(shi)(shi)由于跳(tiao)過了(le)(le)個(ge)(ge)(ge)(ge)體剪(jian)切(qie)位(wei)點(dian)(dian)引起(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)（圖(tu)(tu)4A）。保留的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)布和所有(you)(you)注(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)長度(du)分(fen)布類(lei)(lei)似(si)（圖(tu)(tu)4G）。結果發(fa)(fa)現(xian)只(zhi)(zhi)(zhi)有(you)(you)1,300個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)(yin)有(you)(you)單獨(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體，1,432個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)(yin)有(you)(you)兩(liang)個(ge)(ge)(ge)(ge)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體，每個(ge)(ge)(ge)(ge)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體至少覆蓋(gai)一(yi)次FL CCS read（圖(tu)(tu)4B）。超過3000個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)(yin)有(you)(you)2個(ge)(ge)(ge)(ge)以(yi)上(shang)(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體，這表明(ming)S.pombe中(zhong)轉錄組和AS介導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白調控的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)普遍復雜性(xing)。另外(wai)，第一(yi)次對(dui)擁(yong)有(you)(you)單一(yi)AS事(shi)件(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體（8,739，77.8%）和擁(yong)有(you)(you)多重AS事(shi)件(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體（22.2%）進(jin)行(xing)了(le)(le)區分(fen)（圖(tu)(tu)4C）。為(wei)了(le)(le)檢驗AS事(shi)件(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)析相(xiang)(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)性(xing)，驗證了(le)(le)1708對(dui)可(ke)(ke)(ke)變的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)保留內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)，發(fa)(fa)現(xian)683個(ge)(ge)(ge)(ge)極(ji)相(xiang)(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)對(dui)。相(xiang)(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)性(xing)用基(ji)因(yin)(yin)(yin)間分(fen)子(zi)(zi)關(guan)(guan)(guan)聯值表示，相(xiang)(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)聯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)對(dui)表現(xian)出(chu)了(le)(le)較高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)關(guan)(guan)(guan)聯值，這表示他們(men)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)保留比(bi)互相(xiang)(xiang)(xiang)排(pai)斥(chi)更(geng)加互相(xiang)(xiang)(xiang)關(guan)(guan)(guan)聯（圖(tu)(tu)4J）。盡管在(zai)S.pombe中(zhong)AS是(shi)(shi)(shi)普遍存在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，注(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體在(zai)大(da)多數(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)中(zhong)是(shi)(shi)(shi)占(zhan)(zhan)優勢的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)（3,677個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)(yin)有(you)(you)超過90%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)reads比(bi)對(dui)上(shang)(shang)注(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體）。但是(shi)(shi)(shi)有(you)(you)648個(ge)(ge)(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)(yin)，在(zai)已注(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體占(zhan)(zhan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)例(li)比(bi)可(ke)(ke)(ke)變異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)reads總數(shu)(shu)更(geng)少，（圖(tu)(tu)4D）。大(da)體上(shang)(shang)，匹配上(shang)(shang)注(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)FL CCS reads幾乎(hu)比(bi)匹配上(shang)(shang)新(xin)(xin)異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)reads要多8倍。除了(le)(le)AS型異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體，我們(men)還(huan)發(fa)(fa)現(xian)mRNAs還(huan)明(ming)顯編碼770個(ge)(ge)(ge)(ge)新(xin)(xin)TUs和大(da)約3,800個(ge)(ge)(ge)(ge)至少覆蓋(gai)一(yi)次read的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)反(fan)義異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體。支(zhi)持新(xin)(xin)反(fan)義異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)reads的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)數(shu)(shu)量通常(chang)(chang)比(bi)匹配已注(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)反(fan)義異(yi)(yi)(yi)(yi)構(gou)(gou)(gou)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)reads數(shu)(shu)要少很多（圖(tu)(tu)4E）。在(zai)已注(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)剪(jian)切(qie)位(wei)點(dian)(dian)中(zhong)，99.94%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二核苷酸是(shi)(shi)(shi)GU-AG，只(zhi)(zhi)(zhi)有(you)(you)3個(ge)(ge)(ge)(ge)例(li)外(wai)。但是(shi)(shi)(shi)GU-AG只(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)新(xin)(xin)剪(jian)切(qie)位(wei)點(dian)(dian)中(zhong)出(chu)現(xian)了(le)(le)69.67%，或者在(zai)新(xin)(xin)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)87.5%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)reads中(zhong)（圖(tu)(tu)4I）。標準剪(jian)切(qie)位(wei)點(dian)(dian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)新(xin)(xin)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)和注(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)長度(du)相(xiang)(xiang)(xiang)似(si)，但是(shi)(shi)(shi)非常(chang)(chang)規剪(jian)切(qie)位(wei)點(dian)(dian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)新(xin)(xin)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)大(da)體上(shang)(shang)更(geng)長些（圖(tu)(tu)4H）。將套(tao)索測序和PacBio測序進(jin)行(xing)比(bi)較，發(fa)(fa)現(xian)外(wai)顯子(zi)(zi)跳(tiao)躍，新(xin)(xin)剪(jian)切(qie)位(wei)點(dian)(dian)和新(xin)(xin)內(nei)(nei)(nei)(nei)含(han)(han)(han)子(zi)(zi)三(san)種AS事(shi)件(jian)(jian)(jian)只(zhi)(zhi)(zhi)有(you)(you)少數(shu)(shu)是(shi)(shi)(shi)重疊的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)（圖(tu)(tu)4F），可(ke)(ke)(ke)能是(shi)(shi)(shi)因(yin)(yin)(yin)為(wei)兩(liang)種研究中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)條(tiao)件(jian)(jian)(jian)是(shi)(shi)(shi)獨(du)特的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，還(huan)和捕獲(huo)不同(tong)RNA分(fen)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)技術有(you)(you)關(guan)(guan)(guan)。
圖4 S.pombe減數(shu)分裂期可(ke)變剪切事件(jian)的描述
首先總結了(le)不(bu)同AS事件的(de)(de)(de)(de)(de)(de)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)總體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)變(bian)化(hua)(hua)趨(qu)勢(shi)，用(yong)每種(zhong)類型(xing)對(dui)應的(de)(de)(de)(de)(de)(de)異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)數(shu)(shu)(shu)和(he)reads數(shu)(shu)(shu)表(biao)示(shi)（圖5A）。發現大部(bu)分(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)AS類型(xing)在(zai)減(jian)數(shu)(shu)(shu)分(fen)(fen)裂(lie)期(qi)是(shi)(shi)增(zeng)(zeng)加的(de)(de)(de)(de)(de)(de)趨(qu)勢(shi)，但是(shi)(shi)外(wai)顯(xian)子跳躍(yue)事件在(zai)減(jian)數(shu)(shu)(shu)分(fen)(fen)裂(lie)早期(qi)是(shi)(shi)減(jian)少(shao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，在(zai)后期(qi)卻是(shi)(shi)增(zeng)(zeng)加的(de)(de)(de)(de)(de)(de)；內含子保留相對(dui)沒有變(bian)化(hua)(hua)。下一(yi)步，檢測基(ji)因水平異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)動態變(bian)化(hua)(hua)。多(duo)數(shu)(shu)(shu)個體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)AS異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)豐度(du)在(zai)減(jian)數(shu)(shu)(shu)分(fen)(fen)裂(lie)期(qi)是(shi)(shi)增(zeng)(zeng)加的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，和(he)總體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)趨(qu)勢(shi)一(yi)致（圖5B）。計算基(ji)因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)注(zhu)(zhu)釋(shi)異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)和(he)可(ke)變(bian)異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)對(dui)應的(de)(de)(de)(de)(de)(de)reads數(shu)(shu)(shu)之(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)皮(pi)爾森系(xi)數(shu)(shu)(shu)（圖5C），表(biao)明(ming)大多(duo)數(shu)(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)變(bian)異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)豐度(du)和(he)注(zhu)(zhu)釋(shi)異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)是(shi)(shi)相關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。為了(le)檢測反(fan)相關異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，挑(tiao)選了(le)28個超多(duo)100個FL CCS reads的(de)(de)(de)(de)(de)(de)覆蓋度(du)基(ji)因，以做后續(xu)分(fen)(fen)析。新異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)和(he)注(zhu)(zhu)釋(shi)異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)時間(jian)(jian)進程模式進行比較(jiao)，見熱(re)圖（圖5D）。在(zai)減(jian)數(shu)(shu)(shu)分(fen)(fen)裂(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)中(zhong)期(qi)到(dao)后期(qi)，注(zhu)(zhu)釋(shi)異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)達(da)增(zeng)(zeng)加，同時發現一(yi)個在(zai)減(jian)數(shu)(shu)(shu)分(fen)(fen)裂(lie)早期(qi)表(biao)達(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)48bp內含子保留異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)（圖5E,F）。圖5E是(shi)(shi)外(wai)顯(xian)子-內含子結構(gou)(gou)(gou)(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)實例(li)，圖5F是(shi)(shi)注(zhu)(zhu)釋(shi)異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)和(he)可(ke)變(bian)異(yi)構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)時間(jian)(jian)進程模式。
圖5 減數分裂期可變(bian)剪切的動態(tai)變(bian)化
可(ke)變(bian)剪切的(de)(de)主要作用之一就(jiu)是(shi)(shi)形成同(tong)一基(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)獨(du)特功能的(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)。翻譯預(yu)測(ce)通常是(shi)(shi)從注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)的(de)(de)啟動子開始，會在第一個(ge)(ge)終(zhong)(zhong)止(zhi)(zhi)密碼(ma)子停(ting)止(zhi)(zhi)。測(ce)序(xu)(xu)(xu)分(fen)析共預(yu)測(ce)了18,166個(ge)(ge)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)是(shi)(shi)可(ke)譯的(de)(de)，其(qi)他的(de)(de)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)或是(shi)(shi)屬于(yu)非編(bian)(bian)碼(ma)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)或是(shi)(shi)缺少終(zhong)(zhong)止(zhi)(zhi)密碼(ma)子或是(shi)(shi)已注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)的(de)(de)起始密碼(ma)子（圖(tu)6A）。在4,990個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)中(zhong)，有14,292個(ge)(ge)獨(du)特的(de)(de)可(ke)譯序(xu)(xu)(xu)列(lie)被預(yu)測(ce)。這(zhe)些(xie)基(ji)因(yin)(yin)中(zhong)，2,116個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)被預(yu)測(ce)形成專一的(de)(de)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，2,852個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)被預(yu)測(ce)編(bian)(bian)碼(ma)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)和(he)新蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)。還(huan)有22個(ge)(ge)基(ji)因(yin)(yin)編(bian)(bian)碼(ma)和(he)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)不同(tong)的(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)。大(da)(da)體(ti)上(shang)，新蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)比注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)要短（圖(tu)6B）。我們發(fa)(fa)現編(bian)(bian)碼(ma)新蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)的(de)(de)主模(mo)式是(shi)(shi)長度和(he)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)相似，編(bian)(bian)碼(ma)新蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)次(ci)模(mo)式是(shi)(shi)長度小于(yu)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)20%（圖(tu)6C）。還(huan)有，預(yu)測(ce)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)改變(bian)是(shi)(shi)因(yin)(yin)為可(ke)變(bian)剪切通常發(fa)(fa)生在一個(ge)(ge)編(bian)(bian)碼(ma)序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)開始位置（圖(tu)6D）。整體(ti)上(shang)講，40.3%的(de)(de)帶有AS事件(jian)的(de)(de)可(ke)譯異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)編(bian)(bian)碼(ma)和(he)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)一樣(yang)的(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)。超過半數(shu)的(de)(de)其(qi)他編(bian)(bian)碼(ma)新蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)至(zhi)少部分(fen)和(he)對(dui)應(ying)的(de)(de)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)是(shi)(shi)不同(tong)的(de)(de)閱(yue)(yue)讀(du)框(kuang)（圖(tu)6E）。大(da)(da)約(yue)33.9%編(bian)(bian)碼(ma)新蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)序(xu)(xu)(xu)列(lie)的(de)(de)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)和(he)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)是(shi)(shi)同(tong)樣(yang)的(de)(de)閱(yue)(yue)讀(du)框(kuang)，其(qi)他大(da)(da)約(yue)4.07%的(de)(de)異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)隨閱(yue)(yue)讀(du)框(kuang)轉移(yi)變(bian)化而(er)第二改變(bian)修復(fu)閱(yue)(yue)讀(du)框(kuang)。47.9%的(de)(de)AS異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)的(de)(de)翻譯終(zhong)(zhong)止(zhi)(zhi)于(yu)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)的(de)(de)終(zhong)(zhong)止(zhi)(zhi)密碼(ma)子（圖(tu)6F）。只(zhi)有2.32%的(de)(de)AS異(yi)(yi)(yi)構(gou)體(ti)的(de)(de)翻譯終(zhong)(zhong)止(zhi)(zhi)于(yu)下游但離注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)釋(shi)(shi)(shi)(shi)的(de)(de)終(zhong)(zhong)止(zhi)(zhi)密碼(ma)子很近（圖(tu)6G）。
圖6 預測(ce)檢測(ce)到(dao)的(de)(de)異(yi)構體的(de)(de)翻(fan)譯產物
新(xin)(xin)(xin)序列的(de)(de)(de)(de)保(bao)守性通過用(yong)BLAST和(he)(he)裂殖酵母(mu)，真(zhen)菌和(he)(he)真(zhen)核生(sheng)物(wu)比對(dui)(dui)尋找序列相(xiang)似的(de)(de)(de)(de)蛋白的(de)(de)(de)(de)方法被評估(gu)。二級(ji)(ji)(ji)(ji)和(he)(he)三級(ji)(ji)(ji)(ji)結(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)以及他們的(de)(de)(de)(de)特性使用(yong)RaptorX預測。對(dui)(dui)于(yu)53個(ge)新(xin)(xin)(xin)Tus，大部分和(he)(he)其他裂殖酵母(mu)有同源染色(se)體(ti)(ti)，并沒(mei)有明顯的(de)(de)(de)(de)偏(pian)好（圖(tu)(tu)7A）。另外，檢測了(le)550個(ge)AS異構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)新(xin)(xin)(xin)氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)序列的(de)(de)(de)(de)C端(duan)的(de)(de)(de)(de)保(bao)守性，reads覆蓋(gai)了(le)>2CCS FL reads，長(chang)度至少(shao)是19aa。177個(ge)AS異構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)和(he)(he)其他物(wu)種有同源染色(se)體(ti)(ti)（圖(tu)(tu)7B）。下面，系統(tong)評估(gu)了(le)新(xin)(xin)(xin)蛋白的(de)(de)(de)(de)二級(ji)(ji)(ji)(ji)結(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)形成。注釋蛋白一致表現出低(di)水平(ping)的(de)(de)(de)(de)失序，和(he)(he)注釋ncRBA的(de)(de)(de)(de)最長(chang)ORFs對(dui)(dui)應的(de)(de)(de)(de)假設蛋白表現出完全(quan)的(de)(de)(de)(de)失序（圖(tu)(tu)7C）。研(yan)究(jiu)在插入（內含子保(bao)留）和(he)(he)缺失（外顯子中內含子）氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)序列中的(de)(de)(de)(de)失序殘留物(wu)的(de)(de)(de)(de)模式(shi)(shi)，發現低(di)水平(ping)失序的(de)(de)(de)(de)主(zhu)要模式(shi)(shi)和(he)(he)完全(quan)失序的(de)(de)(de)(de)次模式(shi)(shi)（圖(tu)(tu)7D）。然后，研(yan)究(jiu)AS異構(gou)(gou)(gou)(gou)體(ti)(ti)中可變的(de)(de)(de)(de)C端(duan)氨基(ji)(ji)酸(suan)(suan)如何影響二級(ji)(ji)(ji)(ji)結(jie)構(gou)(gou)(gou)(gou)。圖(tu)(tu)7E表明大多數改變的(de)(de)(de)(de)C端(duan)維持α-helix (H), β-sheet (E). and coil (C)的(de)(de)(de)(de)比例。
圖(tu)7 保守性(xing)和二級結構(gou)分析(xi)
參(can)考文獻：
Kuang Z, Boeke JD, Canzar S. The dynamic landscape of fission yeast meiosis alternative-splice isoforms[J]. Genome Research, 2017, 27(1):145.
