2019-12-17
引言：單細胞(bao)轉(zhuan)錄組測序(Single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)是在單個細胞(bao)水平對 mRNA 進行高通量測序的(de)一項新(xin)技術，能夠有(you)效解決組織樣(yang)本(ben)無法破解的(de)細胞(bao)異質性(xing)難題(ti)，在免(mian)疫、腫(zhong)瘤(liu)研究(jiu)(jiu)領域(yu)可(ke)發(fa)揮重要作用。近期，Cell子刊(kan)Immunity在線(xian)刊(kan)登了(le)美國匹斯堡大學Stephen H. Thorne研究(jiu)(jiu)團(tuan)隊(dui)的(de)最新(xin)研究(jiu)(jiu)成果，該(gai)團(tuan)隊(dui)利用scRNA-Seq等技術手段發(fa)現一種激素(su)——瘦素(su)，可(ke)與溶(rong)瘤(liu)病(bing)毒(du)協(xie)同作用，對腫(zhong)瘤(liu)產生較好的(de)療(liao)效。更令人興奮(fen)的(de)是，瘦素(su)+溶(rong)瘤(liu)病(bing)毒(du)的(de)共(gong)同作用可(ke)激發(fa)機體對腫(zhong)瘤(liu)的(de)免(mian)疫記(ji)憶，為癌(ai)癥免(mian)疫療(liao)法開辟了(le)新(xin)的(de)途徑。
文章題(ti)目(mu)：Oncolytic Viruses Engineered to Enforce Leptin Expression Reprogram Tumor-Infiltrating T Cell Metabolism and Promote Tumor Clearance
發表期刊(kan)：Immunity
發(fa)表時間：2019年
影(ying)響因子(zi)：21.5
技術手(shou)段(duan)：單(dan)細胞(bao)轉錄組(zu)測序scRNA-Seq、流式細胞(bao)術等
1、溶瘤(liu)病(bing)毒(du)是一(yi)類能(neng)夠有效感染并消滅癌細胞的病(bing)毒(du)。 2015年(nian)美國食品藥(yao)品管理局FDA已批(pi)準了一(yi)種單純皰疹病(bing)毒(du)T-VEC用以治(zhi)療(liao)黑色(se)素瘤(liu)。遺憾(han)的是，大多數溶瘤(liu)病(bing)毒(du)療(liao)法單獨使用時不(bu)會產生(sheng)持久反應，腫(zhong)瘤(liu)細胞將迅速產生(sheng)抗藥(yao)性。
2、目前認(ren)為(wei)，T細胞(bao)的(de)代謝不足是限制各類癌(ai)癥免疫(yi)療(liao)效的(de)關鍵：癌(ai)細胞(bao)新陳代謝紊亂，耗(hao)盡了基本營養(yang)物質，使(shi)得腫(zhong)瘤(liu)(liu)浸潤淋巴T細胞(bao)在(zai)缺乏氧氣和(he)養(yang)分的(de)腫(zhong)瘤(liu)(liu)微環(huan)境中無法發揮功能。而(er)有研究表明，T細胞(bao)的(de)代謝重編(bian)程或(huo)腫(zhong)瘤(liu)(liu)微環(huan)境的(de)調節可(ke)以(yi)增強抗腫(zhong)瘤(liu)(liu)免疫(yi)反應。
3、瘦(shou)(shou)素（leptin）是一種(zhong)典型的(de)(de)脂肪因子，具有(you)(you)促進(jin)葡萄糖(tang)及脂肪氧化、線粒(li)體(ti)生物合(he)成等功能(neng)。有(you)(you)研究表(biao)明T細胞表(biao)達瘦(shou)(shou)素受體(ti)，且表(biao)達水平(ping)與炎癥反應有(you)(you)關。目(mu)前瘦(shou)(shou)素的(de)(de)代謝機制相關研究主要(yao)基于肥胖背景展開，未有(you)(you)針對腫瘤的(de)(de)研究。
基(ji)于(yu)以上背(bei)景，本研究利用單細胞轉錄組測序(xu)等手(shou)段，探討了溶(rong)瘤病毒誘導的免疫(yi)反應機制(zhi)、瘦素對T細胞代謝重(zhong)編程的激(ji)活，以及(ji)瘦素+溶(rong)瘤病毒協同作用對腫(zhong)瘤的治療(liao)效果。
1、溶瘤病(bing)毒（VV）可重塑腫瘤免疫微(wei)環(huan)境
在(zai)小鼠皮下(xia)注(zhu)射黑(hei)色素瘤(liu)(liu)(liu)細(xi)胞系CL24，當腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)生(sheng)長至(zhi)直(zhi)徑4mm時，在(zai)瘤(liu)(liu)(liu)內注(zhu)射單(dan)劑(ji)量的(de)(de)溶(rong)瘤(liu)(liu)(liu)牛痘病毒(du)（Vaccinia virus，VV），對(dui)照(zhao)組注(zhu)射PBS。結(jie)果(guo)顯示，VV處理組的(de)(de)小鼠腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)生(sheng)長受(shou)到(dao)抑制，但無實質性(xing)效果(guo)（圖1A）。隨后對(dui)該(gai)處理下(xia)腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)組織(zhi)中(zhong)的(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)胞進行單(dan)細(xi)胞轉錄組測序。無監督聚類數(shu)據分析(xi)顯示，與(yu)對(dui)照(zhao)組相比(bi)，VV組出(chu)現(xian)了CD8+T細(xi)胞、自然殺傷（NK）細(xi)胞和單(dan)核細(xi)胞的(de)(de)流入，而MDSCs和腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)相關(guan)巨噬細(xi)胞比(bi)例下(xia)降(jiang)（圖1B，C）。以上(shang)結(jie)果(guo)表(biao)明，溶(rong)瘤(liu)(liu)(liu)牛痘病毒(du)（VV）可(ke)誘導(dao)腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)免(mian)(mian)疫(yi)微環境的(de)(de)重塑，即引(yin)起免(mian)(mian)疫(yi)細(xi)胞（以T細(xi)胞為主(zhu)）對(dui)腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)組織(zhi)的(de)(de)浸潤，但效果(guo)不(bu)佳，無法完全阻止腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)的(de)(de)生(sheng)長。、
圖1 溶瘤(liu)牛痘(dou)病毒具有強大的免疫(yi)刺激活性
2、溶瘤病毒（VV）對T細胞的促進效(xiao)應(ying)受制于(yu)代謝缺(que)陷
用流(liu)式細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)術分析(xi)經VV處理的(de)小鼠腫(zhong)瘤(liu)浸潤淋巴細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，證實(shi)新免(mian)疫細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)流(liu)入以CD8+T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)為(wei)主（圖2A）；進一(yi)步分析(xi)這些CD8+T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)PD1、Tim-3表(biao)達量及線粒體數量可(ke)發現(xian)（圖2B-D），雖然“新”的(de)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)未完全(quan)耗竭(jie)，但(dan)仍(reng)處于缺(que)氧和代謝(xie)不足(zu)的(de)狀態。該結(jie)果表(biao)明，溶(rong)瘤(liu)病毒雖可(ke)誘導T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)流(liu)入，但(dan)對其在腫(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中遇(yu)到(dao)的(de)代謝(xie)功能障(zhang)礙無能為(wei)力。
圖2 腫瘤浸(jin)潤淋巴細胞分析顯示，VV處理的T細胞存在(zai)代謝(xie)缺陷
3、瘦素(su)（leptin）可激活(huo)T細(xi)胞
體(ti)外(wai)實(shi)(shi)驗(yan)證(zheng)實(shi)(shi)，1.0 nM的瘦(shou)素（leptin）處(chu)理(li)離(li)(li)體(ti)培(pei)養的T細胞可(ke)使其線(xian)粒體(ti)的基礎耗氧率和(he)備(bei)用呼吸能力提高（圖3A）；此(ci)外(wai)，免疫印跡實(shi)(shi)驗(yan)顯示，經瘦(shou)素處(chu)理(li)的T細胞中(zhong)MAPK和(he)轉錄因子ATF-2表達量顯著增加(jia)，而這兩種蛋白(bai)對(dui)線(xian)粒體(ti)的生(sheng)理(li)功能有重要意義（圖3B）。體(ti)內實(shi)(shi)驗(yan)證(zheng)明，相較于正常淋巴(ba)細胞，腫瘤浸潤淋巴(ba)細胞中(zhong)含(han)有更多的瘦(shou)素受(shou)體(ti)，且(qie)活化的T細胞中(zhong)瘦(shou)素受(shou)體(ti)表達量顯著提高（圖3C，D）。綜上，離(li)(li)體(ti)條件下瘦(shou)素可(ke)通(tong)過代謝重編程激活T細胞，且(qie)腫瘤浸潤淋巴(ba)細胞上具備(bei)該(gai)激素的受(shou)體(ti)。
圖3 瘦(shou)素(su)受體在腫(zhong)瘤浸(jin)潤(run)T細胞中上調表達(da)，且瘦(shou)素(su)能激活代(dai)謝重編程(cheng)
4、提高腫瘤微(wei)(wei)環境中局部(bu)瘦(shou)素蛋白濃度可增強抗腫瘤免疫(yi)
通過(guo)基(ji)因編輯設計可表(biao)(biao)達(da)瘦素(su)(su)(su)的(de)黑(hei)色素(su)(su)(su)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)(liu)細胞(bao)CL24-leptin，對照為僅導(dao)入空質粒的(de)黑(hei)色素(su)(su)(su)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)(liu)細胞(bao)CL24-hygro。對小(xiao)(xiao)鼠皮(pi)下(xia)注(zhu)射該細胞(bao)后(hou)(hou)觀察腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)(liu)生(sheng)長情況(kuang)發現(xian)(xian)，相較于CL24-hygro處(chu)理，CL24-leptin處(chu)理的(de)腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)(liu)生(sheng)長速度明顯(xian)減慢（圖4A），且(qie)小(xiao)(xiao)鼠壽命顯(xian)著延(yan)長（圖4B）。這表(biao)(biao)明瘦素(su)(su)(su)可能(neng)會刺激宿(su)主(zhu)產(chan)生(sheng)免(mian)疫。隨后(hou)(hou)利用(yong)T細胞(bao)瘦素(su)(su)(su)受體(ti)缺失的(de)小(xiao)(xiao)鼠進行瘦素(su)(su)(su)過(guo)表(biao)(biao)達(da)實驗，發現(xian)(xian)其腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)(liu)生(sheng)長不受免(mian)疫系統控制（圖4C）。綜(zong)上可知，腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)(liu)微(wei)環(huan)境中瘦素(su)(su)(su)的(de)局(ju)部升高可直接作用(yong)于T細胞(bao)，從而控制腫(zhong)瘤(liu)(liu)(liu)(liu)(liu)生(sheng)長。
圖4 瘦素(su)在(zai)腫瘤細胞中的表達可激活(huo)免疫反應(ying)
5、瘦素(su)可在代(dai)謝層(ceng)面增強腫瘤浸潤淋(lin)巴細胞的功能
利用(yong)CD8+T細胞(bao)(bao)浸潤(run)過(guo)表達瘦(shou)素的腫(zhong)(zhong)瘤(liu)，并對腫(zhong)(zhong)瘤(liu)浸潤(run)淋巴細胞(bao)(bao)進行研究發現(xian)：該細胞(bao)(bao)原(yuan)位增殖更(geng)明顯（圖(tu)5B），線粒體質量增加(jia)（圖(tu)5C），且細胞(bao)(bao)干擾素-γ (IFN-γ)和腫(zhong)(zhong)瘤(liu)壞死因子(zi)α (TNF-α)表達量升高（圖(tu)5A）。說明瘦(shou)素不僅促(cu)進了(le)T細胞(bao)(bao)的浸潤(run)，更(geng)改善了(le)它的代謝功能，且其對T細胞(bao)(bao)的效(xiao)應具有多功效(xiao)性和增值性。
圖5 瘦素從代(dai)謝(xie)水平改(gai)善腫瘤微環境中T細胞(bao)的功(gong)能
6、表達(da)瘦素的溶瘤(liu)病毒（VV-leptin）可介導較強的抗腫瘤(liu)反應(ying)
通(tong)過(guo)基因編輯設計出(chu)可表達(da)瘦素的溶瘤(liu)(liu)牛痘病(bing)(bing)毒（VV-leptin），選擇兩(liang)種對(dui)免疫(yi)治(zhi)療耐藥性強(qiang)的癌(ai)細胞(bao)：黑色素瘤(liu)(liu)細胞(bao)（CL24）和胰腺癌(ai)細胞(bao)（Panc02）構建腫瘤(liu)(liu)小鼠(shu)模(mo)型，分別進行VV-leptin、VV和PBS處理(li)（圖6）。結果表明(ming)，僅注(zhu)射溶瘤(liu)(liu)病(bing)(bing)毒未能(neng)有(you)效控(kong)制(zhi)腫瘤(liu)(liu)生(sheng)長，而瘦素-溶瘤(liu)(liu)病(bing)(bing)毒處理(li)下腫瘤(liu)(liu)生(sheng)長明(ming)顯受到抑制(zhi)，為(wei)小鼠(shu)帶來了顯著的生(sheng)存優勢(shi)。
圖6 瘦素+溶瘤病毒通過(guo)代謝重編程促進抗腫瘤免疫反應
7、 表達(da)瘦素的溶(rong)瘤病毒（VV-leptin）可(ke)誘導(dao)免(mian)疫(yi)記憶
進一步分離VV-leptin、VV和PBS處理(li)后腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)組(zu)織(zhi)中(zhong)(zhong)的T細胞，對其(qi)進行單細胞轉錄組(zu)測序，以(yi)定義其(qi)細胞群。無監督聚類證實，VV-leptin處理(li)組(zu)的腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)組(zu)織(zhi)中(zhong)(zhong)T細胞數目(mu)并不顯著高于VV和PBS處理(li)，但其(qi)表形發生(sheng)了(le)(le)(le)變化(hua)（圖(tu)(tu)7A），屬(shu)于“效應(ying)記(ji)憶(yi)(yi)”和“記(ji)憶(yi)(yi)”的細胞類型增加（圖(tu)(tu)7B）。生(sheng)物(wu)活(huo)體實驗結果更令人興(xing)奮：對VV-leptin處理(li)后治(zhi)愈的11只(zhi)荷(he)瘤(liu)(liu)小(xiao)(xiao)鼠再次接種(zhong)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)，其(qi)中(zhong)(zhong)8只(zhi)小(xiao)(xiao)鼠完全抵抗(kang)了(le)(le)(le)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)的生(sheng)長(chang)，剩余3只(zhi)小(xiao)(xiao)鼠的腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)生(sheng)長(chang)速度也明顯變慢(man)（圖(tu)(tu)7C）。說明經過VV-leptin治(zhi)療后小(xiao)(xiao)鼠獲(huo)得了(le)(le)(le)免(mian)疫(yi)記(ji)憶(yi)(yi)，可以(yi)抵御同種(zhong)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)細胞的再次侵染(ran)。
圖(tu)7 瘦素在溶瘤病毒誘導的(de)免(mian)疫(yi)浸潤中促進(jin)記憶反應
1、單(dan)細胞測序揭示溶瘤病毒處(chu)理的(de)腫瘤中發生免疫(yi)重建。
2、脂肪(fang)因(yin)子瘦(shou)素在(zai)體(ti)內外均可(ke)增強T細胞的代謝功能。
3、溶瘤(liu)病毒+瘦素可增強抗腫瘤(liu)免(mian)疫(yi)，更重(zhong)要的是，二者結合可誘導機(ji)體產生免(mian)疫(yi)記憶(yi)。
原文索(suo)引：Dayana B. Rivadeneira et al. Oncolytic Viruses Engineered to Enforce Leptin Expression Reprogram Tumor-Infiltrating T Cell Metabolism and Promote Tumor Clearance. Immunity, 2019, doi:10.1016/j.immuni.2019.07.003.
原文鏈(lian)接：//doi.org/10.1016/j.immuni.2019.07.003
