2020-02-17
最近(jin)新(xin)型冠狀病毒(du)肆虐(nve)嚴重，眾多做(zuo)科(ke)研的寶寶們是(shi)不是(shi)都(dou)乖乖守(shou)在(zai)家中無聊(liao)著(zhu)呢？這個時候，派森諾給大家送來學習干貨，提供(gong)“精神食(shi)糧”。
根據前文（點擊查(cha)看）可(ke)知，開(kai)放染(ran)色(se)質的(de)研究(jiu)，對于尋(xun)找轉錄前調控核心因子至關(guan)重(zhong)要(yao)。本(ben)次(ci)小編重(zhong)點給大家介紹幾種(zhong)利用(yong)現(xian)有測(ce)序(xu)技(ji)術快(kuai)速獲取開(kai)放染(ran)色(se)質區域的(de)全部信息。
1、直接的開(kai)放染色質(zhi)區域檢測技(ji)術(shu)——DNase-seq技(ji)術(shu)
2008年面市的DNase-seq技(ji)(ji)術是比較(jiao)早出現的，基于二(er)代測序平臺的開放(fang)染色質區研究技(ji)(ji)術。該(gai)技(ji)(ji)術使(shi)用核(he)酸內切(qie)(qie)酶(mei)(mei)DNase I。此(ci)種酶(mei)(mei)類(lei)無(wu)法(fa)酶(mei)(mei)切(qie)(qie)被核(he)小體或其他蛋白保護的DNA片(pian)(pian)段(duan)，優先切(qie)(qie)割開放(fang)染色質區域，因(yin)此(ci)開放(fang)染色質區通常也是DNase I的超敏(min)感位(wei)點(dian)。對于此(ci)類(lei)核(he)酸內切(qie)(qie)酶(mei)(mei)，只要酶(mei)(mei)切(qie)(qie)條件控(kong)制得當（例(li)如酶(mei)(mei)切(qie)(qie)時間，溫度，酶(mei)(mei)的濃(nong)度等），開放(fang)染色質區不會被DNase I酶(mei)(mei)切(qie)(qie)成單堿(jian)基狀態，而(er)只是將(jiang)開放(fang)區DNA酶(mei)(mei)切(qie)(qie)成片(pian)(pian)段(duan)，為后續的測序工作和分析環節(jie)提供可能。但是該(gai)技(ji)(ji)術存在(zai)明顯的不足：
a需要大(da)量細胞
b樣(yang)本制(zhi)備(bei)耗時
c需要精確控制酶切條件，實驗復(fu)雜
實驗流(liu)程
DNase I酶切(qie) ——收集酶切(qie)后(hou)片段（開(kai)放染色質區）——建 庫 ——上(shang)機測序(xu)
2、間接(jie)的開放染色質(zhi)區域檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)——MNase-seq技(ji)術(shu)
2008年面市的(de)MNase-seq是使用(yong)微球菌核(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)酶(mei)(mei)（microccocal nuclease，MNase）這種同時兼具內切(qie)(qie)(qie)和外切(qie)(qie)(qie)酶(mei)(mei)活(huo)性的(de)核(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)酶(mei)(mei)。我是科普小貼(tie)士(shi)：凡是能(neng)水解(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)的(de)酶(mei)(mei)都稱為(wei)(wei)核(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)酶(mei)(mei)。凡能(neng)從(cong)(cong)多核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)鏈的(de)末端開(kai)始(shi)水解(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)的(de)酶(mei)(mei)稱為(wei)(wei)核(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)外切(qie)(qie)(qie)酶(mei)(mei)，凡能(neng)從(cong)(cong)多核(he)(he)(he)(he)(he)苷(gan)酸(suan)(suan)(suan)鏈中間(jian)開(kai)始(shi)水解(jie)核(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)的(de)酶(mei)(mei)稱為(wei)(wei)核(he)(he)(he)(he)(he)酸(suan)(suan)(suan)內切(qie)(qie)(qie)酶(mei)(mei)。因為(wei)(wei)兼具外切(qie)(qie)(qie)酶(mei)(mei)和內切(qie)(qie)(qie)酶(mei)(mei)的(de)活(huo)性，MNase能(neng)逐漸一(yi)步(bu)一(yi)步(bu)的(de)切(qie)(qie)(qie)碎不被核(he)(he)(he)(he)(he)小體(ti)或(huo)其(qi)他蛋白(bai)保(bao)護的(de)DNA，只(zhi)有被核(he)(he)(he)(he)(he)小體(ti)或(huo)其(qi)他蛋白(bai)保(bao)護的(de)DNA不被酶(mei)(mei)切(qie)(qie)(qie)降解(jie)。所(suo)以(yi)該(gai)(gai)技(ji)術(shu)主要(yao)用(yong)于核(he)(he)(he)(he)(he)小體(ti)位置(zhi)研究，開(kai)放(fang)區信(xin)號本身是缺失的(de)（被酶(mei)(mei)切(qie)(qie)(qie)完(wan)全降解(jie)，測(ce)序檢測(ce)不到）。因此，MNase-seq技(ji)術(shu)只(zhi)能(neng)間(jian)接檢測(ce)開(kai)放(fang)染色質區，該(gai)(gai)技(ji)術(shu)存在其(qi)他明顯的(de)不足：
a需(xu)要的細胞數量較多，約10-20百萬個；
b樣本制備費時；
cMNase酶(mei)偏好(hao)切割基因組中AT富(fu)集(ji)區域；
d基因組的某些區(qu)域(yu)比其他區(qu)域(yu)對該核酸(suan)酶消化更(geng)敏感，但具體的機制目前仍不清楚。
實驗流(liu)程
MNase酶切——收集酶切后片段（核小(xiao)體(ti)外DNA）——建 庫(ku) ——上機測序
3、局限的開放染色(se)質區域(yu)檢測技(ji)術——ChIP-seq技(ji)術
ChIP-seq技(ji)術是(shi)將ChIP與(yu)第二代測序(xu)技(ji)術相結合的(de)ChIP-Seq技(ji)術，能夠高效地(di)在(zai)全(quan)基因(yin)(yin)(yin)組范(fan)圍(wei)內檢測與(yu)組蛋(dan)白(bai)(bai)、轉錄(lu)因(yin)(yin)(yin)子等互作的(de)DNA區段(duan)。該(gai)技(ji)術僅支持(chi)研(yan)究(jiu)目(mu)標蛋(dan)白(bai)(bai)在(zai)基因(yin)(yin)(yin)組DNA上(shang)的(de)開放染(ran)(ran)色質(zhi)結合位點序(xu)列研(yan)究(jiu)，要(yao)求(qiu)有明確感(gan)興趣(qu)的(de)目(mu)標蛋(dan)白(bai)(bai)，其次是(shi)該(gai)目(mu)標蛋(dan)白(bai)(bai)有較(jiao)(jiao)為成熟的(de)chip4.級別的(de)抗體，因(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)可使用該(gai)技(ji)術的(de)物種(zhong)和蛋(dan)白(bai)(bai)類(lei)型非常有限；另一(yi)方面，由于免疫共沉淀實(shi)驗的(de)復雜性，需(xu)要(yao)較(jiao)(jiao)長的(de)時間摸索實(shi)驗條件，以期實(shi)驗的(de)成功(gong)和獲(huo)得(de)足量的(de)DNA片段(duan)進行測序(xu)和分析，因(yin)(yin)(yin)此(ci)(ci)ChIP-seq被認為局限的(de)研(yan)究(jiu)全(quan)基因(yin)(yin)(yin)組范(fan)圍(wei)內的(de)開放染(ran)(ran)色質(zhi)技(ji)術。
實驗(yan)流程
免(mian)疫共(gong)沉淀(dian)（ChIP）——富集(ji)目的蛋(dan)白——結合的DNA序列——純化DNA片段——建庫測(ce)序
4、高(gao)噪音(yin)但實驗相對簡單的開放染色質區域(yu)檢測技術(shu)——FAIRE-seq
FAIRE-seq是(shi)(shi)一種基于(yu)酚氯仿抽提原理(li)為(wei)基礎的(de)獲(huo)得開放染色(se)質(zhi)區的(de)檢測(ce)技(ji)術。主要(yao)原理(li)是(shi)(shi)使用超(chao)聲破(po)碎經甲醛固定后染色(se)質(zhi)，得到片段化的(de)的(de)染色(se)質(zhi)，然(ran)后通過酚氯仿抽提，上層水相中即認為(wei)是(shi)(shi)潛在(zai)的(de)開放染色(se)質(zhi)區，然(ran)后針對(dui)開放染色(se)質(zhi)區進行(xing)建庫測(ce)序，獲(huo)得開放區信息，但(dan)是(shi)(shi)該(gai)技(ji)術不足點在(zai)于(yu)：
a原本狀態的(de)染色(se)質結(jie)構復雜，超聲打(da)斷(duan)DNA片段大小不易控制，因此檢測精度較(jiao)差(cha)。
b非開(kai)放區(qu)噪(zao)音(yin)高，導致(zhi)信噪(zao)比低(di)，數據解讀困難，影響(xiang)數據的可靠性
c甲醛固定時間不(bu)易(yi)把(ba)握
實驗(yan)流程(cheng)
甲醛固定染色質 ——超(chao)聲波(bo)打(da)斷——酚(fen)氯仿提取——富集上層水相DNA—— 建庫測序
5、較新較優的(de)開放染色質(zhi)區域直接(jie)檢測技術(shu)——ATAC-seq技術(shu)
2013年面市(shi)的(de)ATAC-seq技術指(zhi)的(de)是(shi)利用DNA轉(zhuan)座酶(mei)(mei)可(ke)以(yi)把DNA序(xu)(xu)列(lie)從(cong)染(ran)色(se)(se)體(ti)(ti)的(de)一個區(qu)(qu)域搬運到另(ling)一個區(qu)(qu)域的(de)特性，用改造后的(de)Tn5轉(zhuan)座酶(mei)(mei)，將轉(zhuan)座DNA設計為測序(xu)(xu)接(jie)(jie)頭(tou)(tou)，從(cong)而直(zhi)接(jie)(jie)將測序(xu)(xu)接(jie)(jie)頭(tou)(tou)引入(ru)開(kai)放(fang)染(ran)色(se)(se)質(zhi)中，進行(xing)捕獲(huo)測序(xu)(xu)。轉(zhuan)座酶(mei)(mei)主(zhu)要切割(ge)(ge)的(de)是(shi)基(ji)因(yin)組上的(de)開(kai)放(fang)染(ran)色(se)(se)質(zhi)區(qu)(qu)，而核(he)小(xiao)體(ti)(ti)致密排列(lie)的(de)閉合染(ran)色(se)(se)質(zhi)區(qu)(qu)，是(shi)無法被切割(ge)(ge)的(de)。轉(zhuan)座酶(mei)(mei)切割(ge)(ge)后，對酶(mei)(mei)切DNA片段進行(xing)富(fu)集純化(hua)，就實現了(le)對基(ji)因(yin)組開(kai)放(fang)區(qu)(qu)的(de)獲(huo)取，另(ling)一方面，轉(zhuan)座酶(mei)(mei)還可(ke)以(yi)切割(ge)(ge)開(kai)放(fang)區(qu)(qu)染(ran)色(se)(se)質(zhi)附近的(de)核(he)小(xiao)體(ti)(ti)間連(lian)接(jie)(jie)區(qu)(qu)DNA，因(yin)此又(you)可(ke)以(yi)同時獲(huo)得核(he)小(xiao)體(ti)(ti)印記信息。簡單(dan)言之，就是(shi)ATAC-seq技術可(ke)以(yi)同時得到DNase-seq和MNase-seq兩種技術的(de)結果(guo)信息。
實驗流程
裂解細(xi)胞(bao)膜獲取細(xi)胞(bao)核——轉座與DNA純化——PCR擴增 ——定量與質控(kong)——上(shang)機測序
DNase-seq、FAIRE-seq和ATAC-seq實驗細胞起始量和實驗時間統計
DNase-seq、FAIRE-seq和ATAC-seq檢測結果信號統(tong)計
使用ATAC-seq技(ji)術研究開放(fang)染色(se)質的
優勢總結(jie)
? 靈敏性高：低細胞(bao)起始量；
? 操作(zuo)簡單，耗(hao)時短(duan)；
?實驗(yan)重(zhong)復性好(hao)(hao)：技術重(zhong)復間(jian)(jian)表現(xian)出非(fei)常(chang)好(hao)(hao)的可重(zhong)復性( R = 0.98) ，并與DHS 測序數(shu)據間(jian)(jian)也(ye)有著較好(hao)(hao)的一致性(R＞0.79)；
?能同時揭示開放染(ran)色質的基(ji)因組(zu)位置(zhi)，DNA結合蛋白，轉錄結合位點的相互作用(yong)
通過上述的說明和比較，現在(zai)大家知(zhi)道(dao)研究開放染(ran)色質區域(yu)該選用哪(na)一種(zhong)檢測技(ji)術了嗎？ATAC-seq，你(ni)值得擁有~不論風(feng)里雨里，派森諾(nuo)在(zai)這里等(deng)你(ni)。
貼心小貼士(shi)：疫情期間，大家做好(hao)安全(quan)防護，少出門，勤洗手，多(duo)看書，多(duo)睡覺(jue)。
