2020-02-24
2019年12月(yue)初(chu)，在我國武(wu)漢(han)地(di)區流行一(yi)種(zhong)(zhong)以發熱、肺(fei)部感染為癥(zheng)狀的(de)(de)傳染性(xing)疾病(bing)(bing)，繼(ji)而肆虐全國，全國各(ge)地(di)甚(shen)至國外(wai)相繼(ji)報(bao)道出現這種(zhong)(zhong)疫情。這種(zhong)(zhong)疾病(bing)(bing)的(de)(de)癥(zheng)狀不同于典型肺(fei)炎(yan)，且對常規抗菌治療無(wu)效，也未鑒定出已知的(de)(de)引(yin)起肺(fei)炎(yan)的(de)(de)細菌或病(bing)(bing)毒等病(bing)(bing)原體。2020年1月(yue)，各(ge)類專家通過(guo)高通量測序證實本次武(wu)漢(han)流行的(de)(de)不明原因(yin)肺(fei)炎(yan)的(de)(de)病(bing)(bing)原體為一(yi)種(zhong)(zhong)以前未知的(de)(de)β屬冠狀病(bing)(bing)毒（見圖1）。
圖1
2019-nCoV基因組(zu)序(xu)列已通(tong)過測(ce)序(xu)解(jie)析完(wan)成(cheng)，結(jie)果顯示基因組(zu)含有約29000個(ge)堿基，有12個(ge)蛋白編碼(ma)區(qu)/開放讀碼(ma)框(kuang)（ORF）（見圖2），包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13、14；與(yu)蝙蝠(fu)SARS樣冠(guan)狀病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21和人SARS冠(guan)狀病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)SARS-CoV 3種冠(guan)狀病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)相應蛋白質(zhi)的(de)長度(du)非(fei)常(chang)相近；其中ORF 1ab為RNA依賴的(de)RNA聚合酶基(ji)因(yin)（RdRp）所在(zai)區域，編(bian)(bian)碼(ma)RNA聚合酶，負責病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)核(he)酸復制(zhi)；S區編(bian)(bian)碼(ma)棘突蛋白，與(yu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)感(gan)染能力相關(guan)，通過與(yu)細胞表面血管緊(jin)張素轉(zhuan)換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結合進入宿主細胞；E區編(bian)(bian)碼(ma)囊(nang)膜蛋白，負責病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)包膜及病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)顆粒的(de)形成(cheng)；M區編(bian)(bian)碼(ma)膜蛋白；N區編(bian)(bian)碼(ma)核(he)殼蛋白，與(yu)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)基(ji)因(yin)組宿主RNA互(hu)相識(shi)別。由于2019-nCoV的(de)RdRp基(ji)因(yin)在(zai)進化樹上與(yu)SARS-CoV的(de)RdRp基(ji)因(yin)顯著不(bu)同，故被列為一種新的(de)β屬(shu)冠(guan)狀病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)。因(yin)而，RdRp基(ji)因(yin)也(ye)成(cheng)為鑒定2019-nCoV核(he)酸的(de)一個重要標志物。
圖(tu)2
中(zhong)國軍網北京1月29日電(dian)（特約記(ji)者莊穎娜 、記(ji)者邵龍飛），1月28日由(you)中(zhong)國(guo)人民解(jie)放(fang)軍軍事(shi)科(ke)學院軍事(shi)醫(yi)學研究(jiu)院與圣湘生物科(ke)技(ji)有限(xian)公司共同研制的新(xin)型冠狀病毒（2019-nCoV）核(he)酸檢(jian)測試劑(ji)盒（RT-PCR熒光探針法(fa)）通過國(guo)家藥品監督管理局應(ying)急審批，獲(huo)得醫(yi)療器(qi)械注冊證書。該檢(jian)測試劑(ji)基(ji)于新(xin)發布(bu)的新(xin)型冠狀病毒（2019-nCoV）基(ji)因(yin)序列(lie)信息，融合熒光定量探針檢測的原理，針對其特異性基因序列進行了雙靶標基因設計。主要(yao)針(zhen)對新型冠(guan)狀病(bing)毒基因組(zu)中開放讀(du)碼框1ab（open reading frame 1ab ， ORF1ab ） 和 核 殼 蛋 白 （ nucleocapsid protein，N）。N基因區(qu)域的引物和特異(yi)性探針。
靶標一（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶標二（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
核酸(suan)提(ti)取(qu)和(he)實時熒光RT-PCR反(fan)應體(ti)系及(ji)反(fan)應條件參考相關廠家試劑盒說(shuo)明。
結(jie)果判斷 陰性:無Ct值或(huo)Ct≥40。 陽性：Ct值<37，可報告為(wei)陽性。
灰度區：Ct值在37-40之間，建議重復實驗，若重做結果Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。在實驗室要確認一個病例為陽性，滿足以下條件： 同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。
為什么探針熒光RT-PCR法，很快成為該病毒高效、便捷的檢測方法呢？
往(wang)下(xia)看(kan)！往(wang)下(xia)看(kan)！往(wang)下(xia)看(kan)！
一、基本(ben)原理
1、熒(ying)光定量PCR原理：是(shi)通過或標記的特異性探針，對PCR產物進(jin)行(xing)標記跟蹤(zong)，反應過程。隨(sui)著PCR 反應的進行，反應產物(wu)不斷累積，熒光信號強度也等比例增加(jia)。每經過一個(ge)循環，收集(ji)一次信號，這樣就(jiu)可以通過熒光強度(du)變(bian)化監測(ce)產物量的變(bian)化，結合相應的軟件對產物進行分析，可以得到熒光擴增曲線，計算待測(ce)樣品初(chu)始模版的量。技(ji)術(shu)是一次由定性技(ji)術(shu)向定量技(ji)術(shu)的(de)飛躍(yue)，運用該項(xiang)技(ji)術(shu)，可(ke)以對(dui)DNA、RNA樣品進行、絕對(dui)定量(liang)和(he)。
圖3
2、TaqMan 熒(ying)光探針是一種寡核苷酸(suan)探針，熒(ying)光基(ji)團連接在探針的5`末端(duan)，而淬滅劑則在(zai)3`末端。PCR擴增(zeng)時在(zai)加入一對引物的(de)同時加入一個特異性的(de)熒光(guang)探針(zhen)，探針(zhen)完整時，報告基團(tuan)發射的(de)熒光(guang)信(xin)號(hao)被淬滅(mie)基團(tuan)吸(xi)收(shou)；PCR擴增時，Taq酶(mei)的5'-3'外切酶(mei)活性將(jiang)探針酶(mei)切降解，使報告熒光(guang)基團和淬(cui)滅(mie)熒光(guang)基團分離，從而熒光(guang)監測系統可(ke)接收到(dao)熒光(guang)信號。
圖4
二、主(zhu)要特點
與染料法相(xiang)比具有更低(di)的(de)(de)背(bei)景信號，更高的(de)(de)靈敏(min)度，可以檢測低(di)于10個分子的(de)(de)模板，更高的(de)(de)特(te)異性(xing)，結果也更準(zhun)確。同時也具有染料法的(de)(de)操作簡單，不影響酶促反應，耗時短（新冠(guan)肺炎病毒檢測需(xu)5-6h就可(ke)以出結果，快(kuai)的測序也要48h）等優點。
三、范圍(wei)廣
探針在流式細胞(bao)技術(shu)、免疫學(xue)、實時(shi)定量PCR技術(shu)、細胞(bao)調(diao)亡(wang)檢測及腫(zhong)瘤細胞(bao)的識別中能應用(yong)。
為什么熒(ying)光定量探(tan)針法在醫學領域(yu)能穩穩的站得(de)住腳呢(ni)，向上(shang)看！向上(shang)看！向上(shang)看！
但(dan)是(shi)(shi)在(zai)(zai)方(fang)便的(de)同時(shi)，前期的(de)研(yan)發，調試等繁瑣的(de)工作，是(shi)(shi)由奮戰在(zai)(zai)前的(de)前輩們經過(guo)日日夜(ye)夜(ye)勞(lao)動(dong)得到的(de)成果(guo)，向他們致(zhi)敬(jing)！
為了向科研人(ren)員致敬，接(jie)下來派(pai)森諾將接(jie)替前(qian)期繁(fan)瑣的工(gong)作，給科研人(ren)員更(geng)多的時間去(qu)思(si)考。
派森諾新(xin)型TaqMan-MGB探針服務(wu)
新型TaqMan-MGB探針技術可以進行基因定量分析，亦可分析基因突變（SNP）。TaqMan-MGB探針與普通TaqMan熒光探針相比具有更短的序列和更高的序列特異性，常被用于SNP分型的研究中。
派森(sen)諾的優(you)勢
派(pai)森諾有自主(zhu)的合(he)成平臺(tai)一次合(he)成及二次合(he)成速度(du)快
一周(zhou)可(ke)以拿到引物、探針(zhen)及各個(ge)環節實驗條件和參數
減(jian)少您摸索的時(shi)間及多次摸索產生的花費
資深博士跟蹤為(wei)您提供有價值的(de)建議
派森諾的(de)服務內(nei)容
內容(rong) | 熒光定量引物、探針 | TaqMan-MGB探(tan)針（多用于SNP、miRNA） |
服務周(zhou)期(qi) | 7個工(gong)作日(ri) | 3～4周 |
公司交(jiao)付結果 | 引(yin)物(wu)、探針成品 | 引(yin)物、探(tan)針成品 |
質粒標準品 | 質粒標準品 | |
實驗條件及電泳圖(tu) | 實驗條件及電泳圖(tu) | |
調試后(hou)的熒光定(ding)量結果 | 調(diao)試(shi)后(hou)的熒光定(ding)量結果 | |
客戶提供信息(xi) | 基因名稱及登錄號 | 基因名稱 |
基因種屬 | 基因種(zhong)屬 | |
實驗的(de)目的(de)及要求(qiu) | 實驗的目的及要求(qiu) | |
TaqMan探針的標記種類 | 默(mo)認為TaqMan-MGB探針 |
派森諾的要求
客戶提供不少于5ug的DNA or cDNA，作為調試模板。若(ruo)不(bu)提供模板，公司(si)進行(xing)調試(shi)，但不(bu)受理(li)售后問題；若(ruo)客(ke)戶提供模板，調試(shi)后，不(bu)出結果或者(zhe)CT值很大，我們會告知，若不再繼續，那么(me)實驗終止(zhi)；若選擇用(yong)我們的模板進行調試(shi)，引物(wu)調試(shi)正(zheng)常后(hou)，發貨，不受理售后(hou)問(wen)題。
派森諾(nuo)服務宗旨(zhi)
把繁(fan)瑣的實驗交給我們(men)，還(huan)你清晰透明(ming)的實驗方案。
