1、為了描述(shu)組蛋(dan)白PTMs（翻譯后修飾）在調節DNA甲(jia)(jia)基(ji)轉移酶(DNMT)靶(ba)向(xiang)和CpG甲(jia)(jia)基(ji)化(hua)中的作用(yong)，使用(yong)ChIP-seq在C3H10T1/2小(xiao)鼠間(jian)充質干(gan)細胞(mMSCs)中分析了組蛋(dan)白PTMs (H3K36me3、H3K36me2、H3K27me3、H3K9me3、H3K4me1)和DNMT3A/B的全基(ji)因組分布模(mo)式。使用(yong)全基(ji)因組亞硫酸(suan)氫鹽(yan)測序(WGBS)在分析CpG甲(jia)(jia)基(ji)化(hua)水平（測序深度(du)45x）。結(jie)果發現H3K36me2和H3K36me3的(de)富集區(qu)域非常(chang)接近(jin)，它們共(gong)同標定了Mb大小(xiao)的(de)區(qu)域，這些區(qu)域基本上不(bu)屬于(yu)H3K9me3和H3K27me3所標定的(de)區(qu)域。

2、為了在另一(yi)個背景下證實上述結果，研究確(que)定了H3K36me2是(shi)否在建(jian)立(li)小鼠胚胎(tai)干細胞(bao)(mESCs)基因(yin)組甲(jia)基化(hua)過程中發揮(hui)了類似的(de)重要作用。在親本(ben)和DNMT3A缺陷(sgDnmt3a)的(de)mESCs中穩(wen)定表(biao)達了主(zhu)要DNMT3A亞型DNMT3A2 (HA)標(biao)記的(de)血(xue)凝素。當表達(da)接近生理水平時，當HA標記的(de)DNMT3A的(de)ChIP-seq顯示其在親代(dai)細胞(bao)和sgDnmt3a細胞(bao)間的(de)全(quan)基因組定位模式(shi)相(xiang)(xiang)似(si)。與H3K36me2/3的(de)ChIP-seq譜相(xiang)(xiang)比(bi)，H3K36me2-DNMT3A與H3K36me3-DNMT3B之間的(de)選(xuan)擇性共富集是明(ming)顯的(de)，但總體上，DNMT3A與DNMT3B在mESCs中(zhong)的(de)分布模式(shi)呈(cheng)正相(xiang)(xiang)關。重(zhong)要的(de)是，DNMT3A的(de)de novo甲基化活性是通(tong)過重新引(yin)入DNMT3A2到Dnmt1和(he)Dnmt3a /b三者共敲除mESCs后的CpG甲(jia)基化水(shui)平來(lai)測量的，這些mESCs幾乎(hu)不存在CpG甲(jia)基化，追蹤H3K36me2的水(shui)平。這與Baubec等人觀察到的DNMT3B的de novo活性(xing)與H3K36me3相關形成了(le)對比(bi)，這表明DNMT3A的(de)基(ji)因(yin)間靶向和DNMT3B的(de)基(ji)因(yin)體靶向共(gong)同促進了(le)在常染色質(zhi)中CpG甲基(ji)化的(de)建(jian)立。

3、NSD家族酶已被證明可(ke)以在基因間區催化H3K36me2。在mESCs中(zhong)，Nsd1是NSD的主要表達酶，而Nsd1和(he)Nsd2均在(zai)mMSCs中表達。因此，研究使用CRISPR/Cas9對(dui)mMSCs中的Nsd1和Nsd2 (sgNsd1/2)或mESCs中(zhong)單獨對Nsd1 (sgNsd1)進(jin)行(xing)了基因基因切除(chu)。以(yi)Setd2被(bei)單(dan)獨打斷(duan)作(zuo)(zuo)為對(dui)照(sgSetd2)。sgNsd1/2和(he)sgSetd2 mMSCs中(zhong)H3K36me2和(he)H3K36me3分別顯著(zhu)減少和(he)特異性(xing)減少，表明這(zhe)兩種酶在染(ran)色(se)質水平上(shang)的(de)作(zuo)(zuo)用明顯。利用添加了果蠅染(ran)色(se)質的(de)ChIP-seq作(zuo)(zuo)為外源性(xing)參考對(dui)照，被(bei)用來(lai)定(ding)量分析親代細胞和(he)H3K36me2 /3缺失細胞之(zhi)間的(de)全基因組變(bian)化(hua)。在(zai)sgNsd1/2 mMSCs和(he)sgNsd1 mESCs中，H3K36me2全面降低，主要在(zai)基(ji)(ji)因間區(qu)。相(xiang)比之下，H3K36me3水平未受干(gan)擾，基(ji)(ji)因H3K36me2的減少相(xiang)對溫(wen)和(he)，這可能是由于NSD3或ASH1L等其他(ta)H3K36甲基(ji)(ji)轉(zhuan)移酶的活性。

4、接(jie)下來，分(fen)析了HA標記(ji)的(de)DNMT3A1(用(yong)于(yu)mMSCs)和(he)DNMT3A2(用(yong)于(yu)mESCs)的(de)全基因(yin)組結(jie)合模式，以及H3K36me2缺(que)失細(xi)胞中的(de)DNA甲基化。通(tong)過刪除mESCs和(he)mMSCs中(zhong)的(de)(de)(de)(de)NSD家族(zu)酶(mei)消除了(le)DNMT3A在基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)間(jian)區域(yu)的(de)(de)(de)(de)招募。全基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)組分析顯示，靶向(xiang)H3K36me2缺(que)失(shi)區域(yu)的(de)(de)(de)(de)DNMT3A缺(que)失(shi)與CpG甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化減(jian)少相一(yi)致(圖2a,c)。根(gen)據H3K36me2和(he)CpG甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化下降之間(jian)的(de)(de)(de)(de)共定位和(he)H3K36me2基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)間(jian)不平衡富集的(de)(de)(de)(de)預測(ce)，sgNsd1/2 mMSCs和(he)sgNsd1 mESCs中(zhong)的(de)(de)(de)(de)CpG低甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化主要(yao)影響(xiang)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)間(jian)區域(yu)(圖2b,d)。重(zhong)新引入野(ye)(ye)生型(xing)NSD1，但(dan)不是催(cui)化突變(bian)型(xing)(C2023A)，能(neng)夠恢(hui)復全面的(de)(de)(de)(de)和(he)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)間(jian)的(de)(de)(de)(de)H3K36me2水平。重(zhong)要(yao)的(de)(de)(de)(de)是，DNMT3A的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)間(jian)定位只(zhi)能(neng)通(tong)過外接野(ye)(ye)生型(xing)NSD1來(lai)恢(hui)復，這表明(ming)NSD1催(cui)化的(de)(de)(de)(de)H3K36me2在將(jiang)DNMT3A招募到非編碼的(de)(de)(de)(de)常染色體區域(yu)中(zhong)有特定的(de)(de)(de)(de)需(xu)求。因(yin)(yin)此(ci)，得出結論(lun)，NSD1在引導DNMT3A進入基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)間(jian)區和(he)維持CpG甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)化方面起著重(zhong)要(yao)和(he)特殊的(de)(de)(de)(de)作用。

5、接(jie)下(xia)來，試圖闡明H3K36me2介(jie)導的DNMT3A募集特異性背后的機制。含有(you)PWWP‘reader’結構域的(de)DNMT3A和DNMT3B都含有(you)可以在體外(wai)與H3K36甲基(ji)化相互作用(yong)。為了測試DNMT3APWWP對不(bu)同價的H3K36甲(jia)基化的特異性(xing)，檢測了純化的DNMT3APWWP結構域和一組半合(he)成核(he)小體(ti)之間的(de)相互作用。DNMT3APWWP與H3K36me2修飾(shi)的核小體的親和力(li)最高(gao)，其(qi)次是(shi)H3K36me3，但不與H3K4、H3K9、H3K27或H4K20的任何(he)價態(tai)結(jie)合。定量等溫滴定量熱(re)法(ITC)測定H3.1或H3.3 K36修飾(shi)肽(tai)段和DNMT3APWWP進一(yi)步支持其優先識(shi)別H3K36me2/3。這些結果(guo)表明DNMT3APWWP可以識別這兩種甲基(ji)化狀態，但對H3K36me2的(de)親和力更強。

6、研(yan)究推(tui)測(ce)，結合H3K36me2的(de)相對豐度，這(zhe)種(zhong)結合偏好有(you)助于DNMT3A在(zai)基(ji)因間區(qu)域(yu)的(de)富集。因此(ci)，驗(yan)證了DNMT3A在(zai)H3K36me2耗盡(jin)時與H3K36me3共定位的(de)假(jia)設。事實上，注意到(dao)在(zai)(zai)sgNsd1/2 mMSCs中(zhong)DNMT3A顯著地重新分配到(dao)基(ji)因體中(zhong)。這不能通過其(qi)與剩余基(ji)因H3K36me2的(de)相互作用來解釋(shi)，因為DNMT3A現在(zai)(zai)顯示出與DNMT3B結合(he)的(de)輪廓，其(qi)中(zhong)信號被(bei)富集(ji)到(dao)基(ji)因體的(de)3 '端(duan)。此(ci)外，在(zai)(zai)親(qin)代mMSCs中(zhong)，DNMT3A在(zai)(zai)高H3K36me3區(qu)(qu)域(yu)(yu)被(bei)耗盡(jin)，而在(zai)(zai)sgNsd1/2細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)，DNMT3A在(zai)(zai)相同區(qu)(qu)域(yu)(yu)被(bei)富集(ji)。sgNsd1/2細(xi)(xi)胞(bao)(TKO)中(zhong)SETD2催化活性的(de)中(zhong)斷破壞(huai)了(le)DNMT3A在(zai)(zai)基(ji)因體中(zhong)的(de)定位，反映(ying)了(le)DNMT3A基(ji)因組重新靶向中(zhong)對H3K36me3的(de)需(xu)求。在(zai)(zai)PWWP區(qu)(qu)域(yu)(yu)引入一個點突變(D333A)，該突變削弱了(le)其(qi)與H3K36me2/3的(de)結合(he)，終止了(le)DNMT3A在(zai)(zai)sgNsd1/2細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)重新定位到(dao)H3K36me3富集(ji)區(qu)(qu)。綜(zong)上所述(shu)，這些結果表明PWWP域優先識別H3K36me2/3引導DNMT3A跨(kua)細胞染色(se)質定位。

7、想知道DNMT3B是否也(ye)會發生類似的(de)(de)(de)再分配機(ji)制。從其定位(wei)模式可以看出，DNMT3B的(de)(de)(de)PWWP結構域(yu)在體(ti)(ti)外優先與H3K36me3重(zhong)組核小體(ti)(ti)結合。在H3K36me3缺失的(de)(de)(de)sgSetd2 mMSCs中DNMT3B的(de)(de)(de)基因體(ti)(ti)定位(wei)缺失伴隨著(zhu)相對溫和的(de)(de)(de)向(xiang)H3K36me2富集的(de)(de)(de)基因間區重(zhong)定向(xiang)的(de)(de)(de)增(zeng)加。總的來說(shuo)，這些數據支持H3K36me2/3比(bi)值(zhi)是(shi)確(que)定(ding)DNMT3A和DNMT3B靶向(xiang)模(mo)式的關鍵決定(ding)因(yin)素，在(zai)一定(ding)程度上(shang)也支持H3K36me2/3比(bi)值(zhi)是(shi)確(que)定(ding)DNMT3A和DNMT3B靶向(xiang)模(mo)式的關鍵決定(ding)因(yin)素。

8、之前報道過，由(you)于NSD1的基(ji)因或(huo)生(sheng)化失(shi)活(huo)導致H3K36me2缺失(shi)的頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCCs)有一個DNA低甲基(ji)化信號。同(tong)樣，在Sotos患者的(de)胚系NSD1單倍(bei)計量不(bu)足的血液(ye)樣本中，DNA甲(jia)基(ji)(ji)化(hua)也(ye)顯著降低。為(wei)了探索研究發現(xian)的疾病相關性，分析了攜帶野生型(xing)(Cal27和Fadu)或突變(bian)型(xing)(SCC-4和SKN-3)的患者來源的HNSCC細胞系中的H3K36me2和CpG甲(jia)基(ji)(ji)化(hua)。盡管有異質的遺傳背景，與NSD1野生型細胞系(xi)相比，NSD1突變細胞系(xi)中的(de)(de)DNA低(di)甲基(ji)(ji)化與(yu)H3K36me2的(de)(de)全基(ji)(ji)因組減少密切相關，且(qie)主要發生(sheng)在(zai)基(ji)(ji)因間(jian)區域。進一步分析了(le)公開(kai)的(de)(de)HNSCC或Sotos患者(zhe)樣本的(de)(de)DNA甲基(ji)(ji)化陣列。與(yu)NSD1野生(sheng)型HNSCC腫瘤相比，NSD1滅活的(de)(de)低(di)甲基(ji)(ji)化探針在(zai)基(ji)(ji)因間(jian)區顯(xian)著富集。與(yu)對照(zhao)組相比，索托斯綜合(he)征患者(zhe)的(de)(de)基(ji)(ji)因間(jian)區也表現出低(di)甲基(ji)(ji)化探針的(de)(de)富集。

9、DNMT3A的(de)(de)錯義突(tu)(tu)變(bian)導致 TBRS，這(zhe)是一(yi)種(zhong)發育障礙，與(yu)Sotos有許多共同(tong)的(de)(de)臨(lin)床特(te)征，包括骨骼過度(du)生長、面(mian)部畸形和(he)智力殘(can)疾。在DNMT3A PWWP區域(yu)(W297del, I310N, Y365C)對TBRS的(de)(de)點突(tu)(tu)變(bian)進行了(le)特(te)征描述。攜帶這(zhe)些突(tu)(tu)變(bian)的(de)(de)重組表達(da)的(de)(de)DNMT3A PWWP結構域(yu)在體(ti)(ti)外(wai)表現出核小體(ti)(ti)結合減少(shao)，表明(ming)它(ta)們可能(neng)損害DNMT3A的(de)(de)染色質(zhi)招募(mu)。事實上(shang)，W297del和(he)I310N突(tu)(tu)變(bian)降(jiang)低了(le)DNMT3A與(yu)大量(liang)染色質(zhi)的(de)(de)關(guan)聯，最近報道(dao)的(de)(de)23個(ge)突(tu)(tu)變(bian)也(ye)伴隨著(zhu)蛋白水平(ping)的(de)(de)降(jiang)低。進一(yi)步檢測與(yu)染色質(zhi)結合的(de)(de)野生型、W297del、I310N或Y365C突(tu)(tu)變(bian)DNMT3A，發現突(tu)(tu)變(bian)DNMT3A復合物中(zhong)核小體(ti)(ti)上(shang)的(de)(de)H3K36me2水平(ping)顯著(zhu)降(jiang)低。因(yin)此，ChIP-seq分析表明，I310N突變(bian)取消了DNMT3A對H3K36me2全基(ji)(ji)(ji)因(yin)組的靶向(xiang)性。因(yin)此，DNMT3A募集障礙和H3K36me2富集的基(ji)(ji)(ji)因(yin)間區CpG甲基(ji)(ji)(ji)化減少是與TRBS和Sotos綜(zong)合征(zheng)相關(guan)的共同特(te)征(zheng)。

10、本研究發現為理解DNA甲(jia)基(ji)化在常染色體基(ji)因(yin)組中是如(ru)何建立(li)和(he)維持的提供了深刻見解。優先靶向DNMT3A和DNMT3B，在它們的PWWP染色質閱讀框(kuang)引導(dao)下，分別將(jiang)CpG甲(jia)基化到H3K36me2富集(ji)的基因間區和H3K36me3富集(ji)的基因體。同(tong)時，H3K4me3在活(huo)性啟(qi)動子(zi)(zi)上(shang)(shang)的(de)(de)(de)存在破壞了DNMT3A/B的(de)(de)(de)ADD結(jie)構(gou)域與(yu)組(zu)蛋白H3之間的(de)(de)(de)相互作(zuo)用，從而(er)保護這(zhe)些區(qu)(qu)域不(bu)受異位(wei)甲基(ji)化(hua)的(de)(de)(de)影響(xiang)。通過招募幾個(ge)CXXC域蛋白，優先識(shi)別(bie)CPG密(mi)集的(de)(de)(de)啟(qi)動子(zi)(zi)，包括參與(yu)活(huo)性DNA去甲基(ji)化(hua)的(de)(de)(de)TET家(jia)族酶(mei)和H3K36去甲基(ji)化(hua)酶(mei)KDM2B，可以進一步確(que)保啟(qi)動子(zi)(zi)上(shang)(shang)DNA甲基(ji)化(hua)的(de)(de)(de)缺失。因此(ci)，認為CpG甲基(ji)化(hua)是(shi)通過DNMT3A/B的(de)(de)(de)聯合(he)作(zuo)用在廣泛的(de)(de)(de)常染(ran)色(se)體區(qu)(qu)域建立的(de)(de)(de)，而(er)轉錄(lu)起始的(de)(de)(de)局部位(wei)點是(shi)保留的(de)(de)(de)。然而(er)，該發現并不(bu)排除DNMT1活(huo)性也受H3K36甲基(ji)化(hua)調控的(de)(de)(de)可能性。此(ci)外，與(yu)H3K36me2/3結(jie)合(he)的(de)(de)(de)DNMT3A/B的(de)(de)(de)結(jie)構(gou)表征(zheng)將是(shi)確(que)定其PWWP域選擇(ze)性識(shi)別(bie)的(de)(de)(de)基(ji)礎。

11、該研(yan)究表明，功能失調的(de)(de)NSD1-DNMT3A跨調節通路導致的(de)(de)基因間DNA低(di)甲基化，代表了兩個(ge)表型重疊的(de)(de)人類過度生長(chang)綜合(he)征(zheng)之(zhi)間的(de)(de)一種機制聯系。這一途徑也可能促(cu)進組織(zhi)腫瘤過度生長(chang)。Nsd1或(huo)Dnmt3a的缺(que)失在鱗狀(zhuang)細胞癌(ai)小(xiao)鼠模(mo)型中促進腫(zhong)瘤的發展(zhan)。

DNMT3A的體細胞突變在急性髓系白血病中很常見，惡性腫瘤中反復發生的將NSD1與NUP98結合導致NSD1異常定位的易位也被觀察到。值得注意的是，包括EZH2和組蛋白H1在內的其他表觀遺傳調控因子的種系突變會導致類似于TBRS和Sotos的發育障礙。此外，DNMT3A的功能獲得突變導致多梳抑制域的異位DNA高甲基化，最近在小鼠和人類中發現這種突變會導致生長延遲和微頭蓋癌。因此，未來的工作是有必要解析復雜的染色質調控網絡控制的DNA甲基化圖譜橫跨廣闊的常染色體區域在細胞分化和生長的控制機制。